Detailansicht
Nachweis von Pistazien- und Haselnussallergenen mittels PCR und qPCR
Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden
Irene Eggner
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Helmut Mayer
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29450.17165.533462-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die vorliegende Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Optimierung von PCR und qPCR-Protokollen und der Überprüfung der Spezifität verschiedener Primer zur Detektion von Haselnuss- und Pistazienallergenen. Arbeitsziel war, mittels PCR und qPCR und geeigneten Primerpaaren, spezifische Gensequenzen von Haselnuss und Pistazie nachzuweisen. Die Konzentrationsbestimmung der isolierten DNA erfolgte mittels photometrischer Messung bei 260 und 280nm und die Qualität der DNA wurde über die Berechnung des Quotienten A260/A280 eruiert. Die Spezifität der Primer wurde mit Hilfe der PCR und anschließender Agarosegelelektrophorese bestimmt, mit dem Ergebnis, dass sich mit dem Primerpaar PistF/PistR, bei einer Annealingtemperatur von 68°C, sehr spezifisch Pistazien-DNA nachweisen lässt und sich keine Kreuzreaktivität mit anderen Nussarten zeigt. Bei den ausgewählten Primern für Haselnuss erwiesen sich die Primerpaare FCor a1_74/RCor a1_229 und CAF02/CAR03 bei einer Annealingtemperatur von 60°C bzw. 63°C als geeignet, Haselnuss-DNA spezifisch nachzuweisen. Der Primer Nocc2F/Nocc1Rbis erwies sich als Primer mit geringer Spezifität und höhere Annealingtemperaturen mussten angewendet werden. Im Anschluss erfolgte die Quantifizierung und die Überprüfung der Spezifität der Primer mittels qPCR. Die Effizienz und die Nachweisgrenze der qPCR-Methode wurde mittels seriell verdünnter Haselnuss- bzw. Pistazien-DNA ermittelt. Die Effizienz betrug im Falle der Primerpaare FCor a1_74/RCor a1_229 und CAF02/CAR03 nahezu 100%. Nach Optimierung des Temperatur/Zeitprogramms betrug die Nachweisgrenze für Haselnuss-DNA, die mit Hilfe dieser Primer detektiert wurde, 7pg/µl. Das Primerpaar Nocc2F/Nocc1Rbis stellte sich auch bei der qPCR als weniger spezifisch, als die beiden anderen Primerpaare heraus. Pistazien-DNA konnte mit hoher Effizienz mit dem Primerpaar PistF/PistR bis zu einer Konzentration von 48fg/µl nachgewiesen werden.
Abstract
(Englisch)
The present thesis deals with the improvement of PCR and qPCR protocols and the validation of the specificity of several primers to detect hazelnuts and pistachio. The aim of this study was to detect specific gene sequences of hazelnut and pistachio with PCR and qPCR techniques, respectively, by using adequate primer pairs. The isolated DNA was quantified by spectrophotometric measurement at wavelengths of 260nm and 280nm. The DNA quality was determined by the evaluation of the A260/A280-ratio. Primer specificity was determined by PCR followed by agarose gel electrophoresis. Results showed that primers PistF/PistR prove to be specific for pistachio at optimized Annealing temperature (AT) of 68°C and did not show any cross-reactivity with other nuts tested. Within the primers selected for the detection of hazelnut, the primer pairs FCor a1_74/RCor a1_229 and CAF02/CAR03 amplified hazelnut specific PCR products at optimized AT of 60°C and 63°C, respectively. For the primers Nocc2F/Nocc1Rbis higher AT were required. Subsequently, primer specificity and quantification was determined by using qPCR. The efficiency and the limit of detection were proven by serially diluted hazelnut and pistachio DNA. In case of primers FCor a1_74/RCor a1_229 and CAF02/CAR03, the efficiency was nearly 100%. After optimizing the temperature/time protocol, the limit of detection was 7pg/µl for hazelnut DNA. Quantitative Real-time PCR did not show acceptable results using primer pair Nocc2F/Nocc1Rbis. This primers were identified to be less specific for the detection of hazelnut. Pistachio DNA could be detected specifically up to an amount of 48fg/µl with the primer pair PistF/PistR.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
allergens pistachio hazelnut PCR qPCR primer DNA isolation methods
Schlagwörter
(Deutsch)
Allergene Pistazie Haselnuss PCR qPCR Primer DNA-Isolierungsmethoden
Autor*innen
Irene Eggner
Haupttitel (Deutsch)
Nachweis von Pistazien- und Haselnussallergenen mittels PCR und qPCR
Hauptuntertitel (Deutsch)
Vergleich verschiedener DNA-Isolierungsmethoden
Paralleltitel (Englisch)
Detection of pistachio and hazelnut allergens using PCR and qPCR - Comparison of different DNA isolation methods
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
XII, 178 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Helmut Mayer
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC08883887
Utheses ID
15690
Studienkennzahl
UA | 474 | | |