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Experimentelle und theoretische Untersuchungen an Penicillium brevicompactum Dierckx
Marcus Seibold
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Karl Peter Wolschann
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29790.10366.871362-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Auf Kulturen von Ascomyceten sind oft flüssige Sekrete zu beobachten, vor allem wenn diese auf festen Nährböden wachsen. Diese Besonderheit wurde auch auf einer Pilz-Kontamination auf Gersten-Gewebe-Kulturen – welche für Transformationsexperimente verwendet wurden – festgestellt. Zwei molekulare Entitäten – ein Protein und eine fluoreszierende Substanz – wurden in den abgesonderten Flüssigkeitströpfchen identifiziert. Inspiriert durch die Fluoreszenz, beschäftigten sich die ersten Experimente dieser Dissertation mit der Identifizierung des Pilzes, gefolgt durch Versuche das Protein und die phenolische Substanz zu charakterisieren. Der Organismus wurde als Penicillium brevicompactum Dierckx identifiziert, ein gut bekannter Produzent von sekundären Metaboliten. Dieser filamentöse Pilz kommt ubiquitär vor und baut in seinem natürlichen Habitat Biomasse ab. Seine Morphologie und Ausmaß der Produktion des flüssigen Sekretes hängt vom Wachstumssubstrat ab. Wenn der Pilz auf Wachstumsmedium für Gerste wächst, hat er einen Lebenszyklus von ca. sieben Tagen und produziert beträchtliche Mengen der stark gelb-grün fluoreszierenden Flüssigkeitströpfchen, den so genannten "Bubbles." Diese sind angereichert mit einem Protein, dem der Name Bubble Protein (BP) gegeben wurde, und welches der Gruppe der Defensine angehört. In dieser Dissertation wird das BP genau charakterisiert und das dazugehörige kodierende Gen samt Promoter und Terminator-Sequenzen bestimmt. Daraus geht hervor, dass das BP über ein Signal-Peptid und eine Vorläufersequenz vor dem reifen Protein verfügt. BP, dessen Sekundär-Struktur hauptsächlich aus beta-Faltblättern besteht hat vier sehr stabile Disulfid-Brücken welche gängigen Reduzierungs-Prozeduren widerstehen. Die strukturelle Klassifikation platziert BP innerhalb der Defensine in die Klasse der Knottin-Faltung und begründet darin die BP-Superfamilie. Das Protein hat anti-Pilz Wirkung und hindert die Hefe Saccharomyces cerevisiae dosisabhängig am Wachstum. Sequenz-Vergleiche zeigten eine hohe Homologie zu fünf weiteren Defensine von verwandten Pilzen. Dies lies eine Vorhersage über die drei-dimensionale Struktur dieser Defensine zu. Weiters wurde entdeckt, dass der verwandte Pilz Penicillium chrysogenum ein BP-homologes Protein im Genom besitzt. Dies ist von Interesse, da P. chrysogenum schon ein bekanntes Defensin – das PAF-Protein – besitzt, und erstmal beschrieben wird, dass ein Pilz über zwei Defensine verfügt. Diese Resultate tragen zu dem aufstrebenden Forschungsfeld von Verteidigungs-Peptiden bei – wovon Defensine eine Sub-Kategorie bilden. Defensine sind typischerweise kleine, positive geladene Proteine mit sechs bis neun konservierten Cysteinen welche Disulfid-Brücken ausbilden. Defensine kommen in fast alle Organismen vor und haben anti-mikrobielle Wirkung. Der zweite Hauptbestandteil der Flüssigkeitströpfchen wurde als Mycophenol-Säure (MPA) identifiziert und ist das am längsten bekannte Antibiotikum. Es wurde vor mehr als 100 Jahren entdeckt und ist auch für die gelb-grüne Fluoreszenz der Flüssigkeitströpfchen verantwortlich. Aber, in all der Zeit seit der Entdeckung war unbekannt das MPA gemeinsam mit BP produziert wird. MPA ist ebenfalls human-biologisch aktiv und ist ein klinisch relevantes Molekül und wird als Regulator des Immunsystems zur Verhinderung der Abstoßungsreaktion nach Organ-Transplantationen angewandt. Möglicherweise ist die Entdeckung der Absonderung von MPA in Form von Flüssigkeitströpfchen ein Anstoß neue Produktionsvarianten zu entwickeln. Die vorliegende Arbeite provoziert die Frage ob noch weitere anti-mikrobielle Moleküle vergesellschaftet mit Defensin-Proteinen vorkommen. In praktischer Hinsicht, könnte die Nährboden-abhängige Morphologie des Pilzes die Basis für neue Ideen bezüglich der Ernte von sekundären Pilz-Metaboliten legen.
Abstract
(Englisch)
Liquid exudates are often observed on surfaces of ascomycte colonies, especially when these are grown on solid media. This property was observed on a colony of a fungal contaminant growing on tissue culture plates used in transformation experiments with barley. Two molecular components were identified as major components of the exudate bubbles, namely one protein and one fluorescent substance. Inspired by that finding, the first scope of the experiments described in this dissertation was to identify the fungus in question, followed by attempts to characterize the protein and also the phenolic compound. The organism was identified as Penicillium brevicompactum Dierckx, a well known producer of secondary metabolites. This filamentous fungus is ubiquitous and degrades biomass in its natural habitat. Its morphology and rate of liquid exudate production is different depending on the growth substrate. When grown on a barley plant medium, it has a life cycle of about seven days and produces a significant volume of bright, yellow-green fluorescent liquid exudate bubbles (hereafter often just referred to as bubbles). The bubbles are enriched in one protein, named bubble protein (BP). Detailed characteristics of this protein are described, and also it’s corresponding genomic promoter and terminator sequences that flank sequences encoding signal peptide and a precursor sequence upstream of that of the mature protein. BP, the structure of which mainly consists of beta sheets, has four very stable disulfide bridges that resist standard procedures for reduction. Structural classification places BP into the group of proteins with a knottin fold (SCOP classification, Murzin 1995), founding the BP superfamily. The protein revealed anti-fungal effects as it inhibits growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae in a dose-dependent manner. Based on protein sequence alignments that revealed very high homology to five defensin-proteins of related fungi, a 3D structure prediction of the corresponding proteins was made. In addition, it was discovered that the closely-related fungus Penicillium chrysogenum encodes a BP homolog – in addition to its PAF protein, which is also similar to BP – further suggesting that fungi may possess more than one defensin. These results are pertaining to an emerging field of research about host defense peptides to which defensins represent a subcategory. The typical defensin is a small, cationic protein with six to eight conserved cysteins which form disulphide bridges. They are found in almost every species and often associated with antimicrobial activity. The second major constituent of the bubble was identified as mycophenolic acid (MPA), which was the first known antibiotic (Bentley 2000). It was discovered more than 100 years ago, and now known to generate the characteristic yellow-green fluorescence of the bubbles. However, it remained unnoticed until now that MPA was co-produced with BP. MPA has also a biological activity and is a clinically relevant small molecule as modulator of the human immune system response to organ transplants, so the observation of its presence in bubbles may point to an alternative source for production and purification. The work described herein provoked the question whether other antimicrobial small molecules also are "in company" with defensin proteins. Further, if one species has more than one defensin, how can a potential synergistic action help the host to fend of nutrient competitors. In practical terms, the nutrient-dependent morphology could form the basis for new ideas on the harvest of secondary metabolites fungi.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
antimicrobial peptides defensins Bubble Protein mycophenolic acid
Schlagwörter
(Deutsch)
Antimikrobielle Peptide Defensine Bubble Protein Mycophenolsäure
Autor*innen
Marcus Seibold
Haupttitel (Englisch)
Experimentelle und theoretische Untersuchungen an Penicillium brevicompactum Dierckx
Paralleltitel (Englisch)
Experimental and theoretical investigations of Penicillium brevicompactum Dierckx
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
104 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Uffe Mortensen ,
Gottfried Koehler ,
Manuel Pastor
Klassifikationen
35 Chemie > 35.11 Quantenchemie, chemische Bindung ,
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC10812117
Utheses ID
21195
Studienkennzahl
UA | 791 | 419 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1