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Reconstitution of the human cohesin complex

Pim Huis in't Veld

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Jan-Michael Peters

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29656.26871.340654-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Um in der Mitose einen fehlerfreien Transfer des genetischen Materials in die entstehenden Tochterzellen zu garantieren, muss der physikalische Zusammenhalt der Schwesterchromatiden, ab dem Zeitpunkt ihrer Synthese bis zum Eintritt in die Anaphase, gegeben sein. Dieser Zusammenhalt wird von dem Proteinkomplex Cohesin aufrechterhalten. In Vertebratenzellen dissoziiert ein erheblicher Teil von Cohesin bereits in einem frühen Stadium der Mitose von den Chromosomarmen. Das verbleibende Cohesin am Zentromer ist verantwortlich für die typische X-Form der kondensierten humanen Chromosomen. Um den Transfer der Chromosomen zu den gegenüberliegenden Polen zu ermöglichen, wird das restliche Cohesin von dem Enzym Separase geschnitten. Cohesin gehört zur den SMC-Komplexen, die generell eine strukturformende Rolle an den Chromosomen spielen. Ihnen ist gemeinsam, dass die langen coiled-coil-Regionen zweier Proteine an den jeweiligen Enden interagieren. Durch diese Art der Interaktion ergibt sich für den Cohesin-Komplex eine ringartige Struktur mit einem Durchmesser von rund 30 nm. Es wird angenommen, dass Cohesin die DNA sowohl vor als auch nach der Replikation topologisch umschließt. Die Fähigkeit von Cohesin zwei DNA-Stränge zusammenzuhalten spielt, neben der Funktion in der Mitose, auch eine entscheidende Rolle in der Reparatur von DNA-Schäden, der allgemeinen Formgebung von Chromosomen und dem Zusammenhalt der Schwesterchromatiden in Meiose-arretierten Oozyten. Funktionsdefizite im Cohesin Komplex können folglich zu angeborenen Fehlbildungsmustern, wie dem Cornelia de Lange Syndrom, und zu altersbedingter Infertilität der Frau führen. Um die vielfältigen Aufgaben von Cohesin und ihre Regulation in den jeweiligen Prozessen besser zu verstehen, müssen zuerst die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen entschlüsselt werden. Um diesem Ziel näher zu kommen, rekonstruierten wir humane Cohesin-Komplexe und Subkomplexe mit Hilfe von Insektenzellexpression. Die charakteristische Form von Cohesin wurde mittels Elektronenmikroskopie (EM) analysiert. Das gezielte Schneiden von rekombinantem Cohesin zeigte die dramatische Konformationsänderung des Komplexes, wenn das Protein Scc1 geschnitten wird. Rekombinante Komplexe haben funktionierende ATP-Bindungs- und Hydrolysedomänen und wir konnten in Anwesenheit von Scc1 einen starken Anstieg der ATPase-Aktivität von Smc1/3 beobachten. Desweiteren induzierte die Co-Expression von Cohesin mit einer Acetyltransferase die Acetylierung von Smc3 an den Positionen K105 und K106. Interessanterweise war diese Modifizierung in mutierten Komplexen ohne ATP-Bindungsfunktion nicht mehr detektierbar. Nachfolgend initiierten wir eine 3D-Rekonstruktion von Cohesin-Komplexen und Subkomplexen mit EM und Einzelmolekül-Analyse. Da bei dieser Art von Experimenten die Homogenität der Proteinpräparation eine wesentliche Rolle spielt, wurde ein ‘Bonsai‘-Konstrukt generiert, welchem die langen und flexiblen coiled-coil-Regionen von Smc1 und Smc3 fehlen. Zusätzlich wurde das rekombinante Cohesin chemisch crossgelinkt und mittels Massenspektrometrie analysiert. Diese innovative Technik erlaubte uns neue und interessante Verbindungen zwischen den einzelnen Cohesin-Untereinheiten zu identifizieren. Desweiteren haben wir Fortschritte gemacht rekombinantes Cohesin mit Hilfe von Xenopus-Ei-Extrakt auf beliebige DNA-Abschnitte zu laden. Solch ein in vitro System, hat das Potential, die regulatorischen Mechanismen des Ladungsprozesses und der Cohesin-DNA-Interaktion genau zu erfassen.

Abstract

(Englisch)

In order to faithfully segregate the genetic content of a cell into two daughter cells, sister chromatids must be kept together from their synthesis until the metaphase to anaphase transition. The cohesion between chromatids is mediated by a protein complex called cohesin. In vertebrate cells, the majority of cohesin dissociates from the chromosome arms at the onset of mitosis and the protection of cohesin near the centromere results in the characteristic X-shape of condensed human mitotic chromosomes. Only after the remaining centromeric cohesin has been cleaved by an enzyme called separase, sister chromatids can segregate to the opposite poles of the dividing cell. Cohesin belongs to the family of SMC complexes, involved in the structural maintenance of chromosomes. A common hallmark of these complexes is the interaction between two extended coiled-coil containing proteins at both ends. For cohesin, this results in the formation of a ring-like assembly with a diameter of around 30 nm. It has been proposed that cohesin can bind DNA before and after replication by physically entrapping it inside this ring. Cohesin’s ability keep two molecules of DNA together is not only important during the mitotic cell division. The repair of DNA damage, the general organization of chromatin structure and the sister chromatid cohesion in oocytes arrested in meiosis are all controlled by cohesin. Aberrant functioning of cohesin can therefore lead to DNA damage hypersensitivity, congenital disorders such Cornelia de Lange or Down syndrome and age-related female infertility. However, before we can address how cohesin is regulated during these processes, it is essential to understand the functioning of cohesin at a more fundamental level. To do so, we reconstituted human cohesin complexes and subcomplexes from proteins expressed in insect cells. The characteristic architecture of cohesin was analyzed by electron microscopy. The controlled cleavage of recombinant cohesin highlighted the dramatic conformational changes that complexes undergo upon the disruption of Scc1 at the metaphase to anaphase transition. Recombinant complexes have a functional ATP-binding and -hydrolysis module, and the presence of Scc1 was found to boost the ATPase activity of Smc1/3. Co-expression of cohesin and an acetyltransferase in insect cells induced the acetylation of Smc3 at positions K105 and K106. Interestingly, this double acetylation could not be observed for complexes deficient in ATP-binding. We initiated the 3D-reconstruction of cohesin complexes and subcomplexes using electron microscopy and single-particle analysis. Because the sample homogeneity directly contributes to the success of this approach, ‘bonsai’ cohesin complexes that lack the long and flexible coiled-coils of Smc1 and Smc3 were generated. To identify protein-protein interaction interfaces and to extract more information from 3D reconstructions, recombinant cohesin was chemically cross-linked and analyzed by mass spectrometry. Using this novel technique, we could identify informative and interesting cross-links within and between cohesin subunits. We made progress towards the loading of recombinant human cohesin onto a DNA template of choice using Xenopus egg extracts. An in vitro system that recapitulates how cohesin interacts with DNA in vivo has the exciting potential to systematically unravel the mechanisms behind the loading and the regulation of cohesin bound to DNA.

Autor*innen

Pim Huis in't Veld

Haupttitel (Englisch)

Reconstitution of the human cohesin complex

Paralleltitel (Deutsch)

Rekonstitution des humanen Cohesin Komplexes

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

166 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Daniel Gerlich ,

Stefan Westermann

Klassifikationen

35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10808424

Utheses ID

22960

Studienkennzahl

UA | 094 | 490 | |

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