Detailansicht

Production and characterisation of two allergen-modulator fusion proteins
Julia Kalser
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Thomas Decker
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29800.23755.272663-6
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Toll-like-Rezeptor (TLR)-Liganden sind starke Stimulatoren des Immunsystems und eignen sich daher als Adjuvantien in der allergenspezifischen Immuntherapie. Der TLR5-Ligand Flagellin (Flg) hat nachweislich Adjuvanswirkung und immunmodulatorische Eigenschaften. Es wurde bereits gezeigt, dass ein Fusionsprotein bestehend aus einem Influenzaprotein und Flg ohne Beimischung von Adjuvantien in Mäusen starke Antikörperantworten hervorrufen kann. In einer in vitro Studie mit Mauszellen hatte ein Fusionsprotein aus Flg und dem Allergen Ovalbumin im Vergleich zu einem Gemisch aus Flg und Ovalbumin stärkere immunomodulatorische Effekte. Da die zentrale, hypervariable Domäne von Flg für die TLR5-Aktivierung nicht notwendig ist und neutralisierende Antikörper induzieren kann, wurde eine verkürzte Variante des Proteins hergestellt, die N turn C Flagellin (NtCFlg) genannt wurde. NtCFlg konnte nach wie vor TLR5 aktivieren. Daher wurden aus NtCFlg und Bet v 1, dem Hauptallergen aus Birkenpollen, zwei Fusionsproteine hergestellt, die Bet v 1-NtCFlg und NtCFlg-Bet v 1 genannt wurden. In dieser Arbeit wurden diese Fusionsproteine hinsichtlich ihrer Immunogenität und Allergenität charakterisiert. Nach erfolgreicher Adaptierung von Protokollen zur Herstellung von Bet v 1-NtCFlg und NtCFlg-Bet v 1 als rekombinante Proteine, wurde die Aktivierung von TLR5 bestätigt. Beide Fusionsproteine induzierten stärkere TLR5-Aktivierung als natives Flagellin. In vitro wurden Bet v 1-spezifische IgE Antikörper signifikant schwächer von Bet v 1-NtCFlg und NtCFlg-Bet v 1 gebunden als von Bet v 1 alleine. Höhere Konzentrationen der Fusionsproteine als Bet v 1 wurden benötigt, um bei basophilen Zellen von Ratten die IgE-vermittelte Ausschüttung von Mediatoren hervorzurufen. Diese Ergebnisse weisen auf ein hypoallergenes Potential der Fusionsproteine hin. In BALB/c Mäusen konnten beide Fusionsproteine ohne Aluminiumhydroxid Antikörperantworten induzieren, was auf die Adjuvanseigenschaften von NtCFlg zurückzuführen ist. Außerdem lösten die Fusionsproteine stärkere Immunantworten als die Mischung aus Bet v 1 und NtCFlg oder Bet v 1 alleine aus. Zusammenfassend resultierte die Fusion eines modifizierten TLR5-Liganden mit einem Hauptallergen in Proteinen mit intrinsischer Adjuvanswirkung und reduzierter IgE-Bindungskapazität. Da Bet v 1-NtCFlg einfacher und in größeren Mengen als NtCFlg-Bet v 1 aufgereinigt werden konnte und in Mäusen vorteilhaftere Immunantworten induzierte, kann dieses Fusionsprotein als vielversprechender Kandidat für die Allergen-spezifische Immuntherapie betrachtet werden.
Abstract
(Englisch)
Toll-like receptor (TLR) ligands are potent stimulators of the immune system and thus can be used as adjuvants in allergen-specific immunotherapy (SIT). The TLR5-ligand flagellin (Flg) has been reported to have adjuvantic and immunomodulatory properties. A fusion protein consisting of influenza protein and Flg has been used as influenza-vaccine for mice and was able to induce strong antibody responses without adjuvants. Furthermore, in a murine in vitro system a fusion protein consisting of Flg and the allergen ovalbumin induced immunomodulatory responses that were much stronger as the mixture of Flg and allergen. Since the central, hypervariable domain of Flg is not necessary for TLR5-activation and is known to induce neutralising antibodies, a truncated version of the protein was created that was called N turn C flagellin (NtCFlg). NtCFlg still activated TLR5. Consequently, two fusion proteins consisting of NtCFlg and Bet v 1, the major allergen of birch pollen, were created and named Bet v 1-NtCFlg and NtCFlg-Bet v 1. In this work, these fusion proteins were characterised regarding their immunogenicity and allergenicity. After successful adaption of protocols to produce Bet v 1-NtCFlg and NtCFlg-Bet v 1 as recombinant proteins, TLR5-activation was confirmed. Both fusion proteins induced stronger TLR5-activation than full length Flg. In vitro Bet v 1-NtCFlg and NtCFlg-Bet v 1 bound significantly less Bet v 1-specific IgE than Bet v 1 alone. Higher amounts of the fusion proteins than of Bet v 1 were needed to induce IgE-mediated mediator release in rat basophilic leukaemia cells. These data are indicative of a hypoallergenic potential of the fusion proteins. In BALB/c mice both fusion proteins induced antibody responses in the absence of aluminium hydroxide, confirming the adjuvantic properties of NtCFlg. Furthermore, the fusion proteins elicited enhanced immune responses in comparison to the mixture of Bet v 1 and NtCFlg, and Bet v 1 alone. In summary, the fusion of a modified TLR5-ligand and a major allergen resulted in proteins with intrinsic adjuvanticity and reduced IgE-binding capacity. Since Bet v 1-NtCFlg was easier to purify, reached higher protein yields and induced more favourable immune responses in mice than NtCFlg-Bet v 1, this fusion protein may be considered a promising candidate for allergen-specific immunotherapy.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
immunology allergy toll-like receptor adjuvant allergen-specific immunotherapy
Schlagwörter
(Deutsch)
Immunologie Allergie Toll-like Rezeptor Adjuvans allergenspezifische Immuntherapie
Autor*innen
Julia Kalser
Haupttitel (Englisch)
Production and characterisation of two allergen-modulator fusion proteins
Paralleltitel (Deutsch)
Herstellung und Charakterisierung zweier Allergen-Modulator Fusionsproteine
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
80 S. : Ill.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Barbara Bohle
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.45 Immunologie
AC Nummer
AC10809259
Utheses ID
24878
Studienkennzahl
UA | 441 | | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1