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Structural studies of the bacterial type III secretion system
Matthias Brunner
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Thomas Marlovits
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29598.68132.750059-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Die Resistenz gegen klinisch zugelassene Antibiotika ist im Ansteigen begriffen. Daher wird die Untersuchung von Infektionsmechanismen neue Targets für Antibiotika identifizieren und könnte schließlich zur Entwicklung von neue antibakteriellen Wirkstoffen führen. Das Typ-III Sekretionssystem (T3SS) ist essentiell für die Virulenz von Gram-negativen Pathogenen wie Yersinia, Shigella und Salmonella. Es transloziert seine Substratproteine in die Zellen des eukaryotischen Wirts, um Teile der Zellmaschinerie zu übernehmen. Der Nadelkomplex (NK) ist eine zentrale Komponente des T3SS, er bildet schließlich einen Transportkanal über drei Lipidmembranen hinweg. Alle Versuche in dieser Arbeit wurden durchgeführt am NK, der sich auf der Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 (SPI-1) im bakteriellen Chromosom befindet. Der NK wurde dafür zuvor in S. typhimurium-Zellen exprimiert und aus deren Membranen aufgereinigt. Als großer Membranproteinkomplex (Molekulargewicht von ungefähr 3.5 MDa) ist der NK geeignet für die Rekonstruktion aus Einzelpartikeln (Einzelpartikelrekonstruktion - EPR), gewonnen aus Kryoelektronenmikroskopieaufnahmen. Die Aufnahmen wurden bei 300 kV auf einem FEI Tecnai G2 Polara-Mikroskop gesammelt, bei Flüssigstickstoff-Temperaturen. Elektronendichtekarten des SPI-1-NK bis zu einer Auflösung von unter einem Nanometer waren bereits bekannt (EMDatabank-Einträge 1871, 1874, 1875). Diese wurden mit konventionellen EPR-Methoden erstellt, die auf dem Kreuzkorrelationskoeffizienten als Abgleichungsgütekriterium basieren. Bayes'sche EPR, wie sie im Softwareprogramm RELION implementiert ist, ermöglichte die Rekonstruktion des Innenmembranrings 1, der aus den Proteinen PrgH und PrgK in mehrfacher Ausführung besteht und einer C24-Symmetrie folgt, bis zu einer Auflösung von etwa fünf Angström nach der Goldstandard-Fourierhüllenkorrelation. Das erlaubt das zuverlässige Einpassen von Sekundärstrukturmerkmalen und die Platzierung von großen Aminosäurenseitenketten, zusätzlich zum Nachverfolgen von Loop-Regionen, für die noch keine Kristallstruktur existiert. Zusammengefasst lässt sich festhalten, dass dieses Resultat Einblicke mit atomarer Auflösung in die Ringassemblierung eines makromolekularen Komplexes, der von großer Bedeutung für Gram-negative Infektionsprozesse ist, gewährt.
Abstract
(Englisch)
Resistance to antibiotics approved for clinical use is emerging among pathogens. Investigating infection mechanisms will identify new targets for antibiotics and could eventually lead to the development of novel antibacterial drugs. The type III secretion system (T3SS) is an essential infection mechanism of Gram-negative pathogens such as Yersinia, Shigella and Salmonella. It translocates its substrate proteins into the eukaryotic host cell, in order to hijack parts of the host cell machinery. The needle complex (NC) is the key component of the T3SS, eventually forming a conduit across three lipid bilayers. All of the studies in this thesis were conducted on the NC that is encoded on the Salmonella pathogenicity island 1 (SPI-1), upon expression in and purification from S. typhimurium cells. As a large membrane protein complex (molecular weight of about 3.5MDa), the NC is amenable to single-particle reconstruction (SPR) from cryo electron micrographs. The micrographs were collected at 300kV on a FEI Tecnai G2 Polara microscope at liquid nitrogen temperatures, on a conventional charge-coupled device. Electron density maps of the SPI-1 NC, at sub-nanometre resolution, were already known (EMDatabank entries 1871, 1874, 1875). These maps were generated by conventional SPR methods, based on the cross-correlation co-efficient as a goodness-of-fit measure in projection matching. Bayesian SPR as implemented in the programme RELION, a recent advance in image processing, enabled reconstruction of the NC's inner membrane ring 1, consisting of the proteins PrgH and PrgK in multiple copies and observing a C24 symmetry, to a resolution of about five angstroms according to the gold-standard Fourier-shell correlation. This allowed the fitting of secondary structure features and placement of bulky amino-acid side chains with confidence, in addition to tracing loop regions for which the single-subunit crystal structure diverges or does not exist. Taken together, this finding provides insights into the ring assembly of a macromolecular complex that is central to Gram-negative infection processes, at atomic resolution.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Salmonella needle complex electron microscopy cryo electron microscopy single-particle reconstruction type III secretion system T3SS membrane protein complex
Schlagwörter
(Deutsch)
Salmonella Nadelkomplex Elektronenmikroskopie Kryo-Elektronenmikroskopie Einzelpartikelrekonstruktion Typ-III Sekretionssystem T3SS Membranproteinkomplex
Autor*innen
Matthias Brunner
Haupttitel (Englisch)
Structural studies of the bacterial type III secretion system
Paralleltitel (Deutsch)
Strukturelle Studien über das bakterielle Typ-III-Sekretionssystem
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
195 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Sjors Scheres ,
Kristina Djinovic-Carugo
Klassifikationen
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.12 Biophysik ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC11322062
Utheses ID
27820
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1