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Einfluss von verschiedenen Punktmutationen in den transmembranären Domänen der α- und β-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors auf die Modulation von I-GABA durch den Liganden BK06
Katharina Keusch
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Steffen Hering
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29576.70238.518662-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
γ-Aminobuttersäure (GABA) Subtyp A (GABAA) Rezeptoren sind die wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter-Rezeptoren im Säugergehirn. Dysfunktionen im GABAergen System werden mit einer Reihe von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen assoziiert, weshalb GABAA-Rezeptor-Liganden interessante Targets für die Behandlung derartiger Krankheitsbilder darstellen. GABAA-Rezeptoren sind heteromere, ionotrope Chloridkanäle, die aus fünf Untereinheiten aufgebaut sind. Die vier transmembranären Domänen (TM 1-4) jeder Untereinheit verankern den GABAA-Rezeptor in der Zellmembran und sind Angriffspunkte für zahlreiche GABAA-Liganden, wie beispielsweise Etomidat, Loreclezol oder Propofol. Im Rahmen dieser Diplomarbeit sollte untersucht werden, inwieweit sechs ausgewählte Punktmutationen (β3T262S, β3N265S, β3T266A, β3M286W, β3F289S und α1M235W) in den transmembranären Domänen der α1- oder β3-Untereinheit des GABAA-Rezeptors Einfluss auf die Modulation des GABA-induzierten Chloridstroms (IGABA) durch den Liganden BK06 haben. Dazu wurden der α1β3γ2S Wildtyp sowie die punktmutierten Rezeptoren (α1β3T262Sγ2S, α1β3N265Sγ2S, α1β3T266Aγ2S, α1β3M286Wγ2S, α1β3F289Sγ2S und α1M235Wβ3γ2S) in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und die Modulation von IGABA durch BK06 mit Hilfe der 2-Mikroelektroden-Spannungsklemmtechnik und einem schnellen Perfusionssystem untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine Aminosäure in α1 (M235) sowie drei Aminosäuren in β3 (N265, M286, F289) für die Interaktion von BK06 mit dem GABAA-Rezeptor von besonderer Bedeutung sind: Während BK06 α1β3γ2S Rezeptoren potent und effizient modulierte (Emax = 694 ± 140 %, EC50 = 24,1 ± 8,8 μM), konnte an den vier gennannten punktmutierten Rezeptoren eine signifikante Reduktion der IGABA Modulation durch BK06 beobachtet werden (β3N265S: Emax = 118 ± 39 %, β3M286W: Emax = 35 ± 24 %, β3F289S: Emax = 248 ± 100 %, α1M235: Emax = 184 ± 17 %). Die beiden weiteren Mutationen (β3T262S und β3T266A) führten im Gegensatz dazu zu keiner signifikanten Veränderung der maximalen Modulation von IGABA, was darauf hinweist, dass diese beiden Threoninreste nicht zwingend an der Interaktion von BK06 mit dem Rezeptor beteiligt sind. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass einzelne Punktmutationen in den transmembranären Domänen der α1- und β3-Untereinheit des GABAA-Rezeptors signifikant die IGABA-modulierende Wirkung von BK06 beeinflussen. Weiterführende Studien könnten zeigen, ob zusätzliche Aminosäuren in der unmittelbaren Umgebung ebenfalls für die modulierende Wirkung von BK06 essentiell sind und somit gemeinsam mit den bereits identifizierten Aminosäuren eine potentielle Bindungsstelle darstellen.
Abstract
(Englisch)
γ-aminobutyric acid (GABA) subtype A (GABAA) receptors are the major inhibitory neurotransmitter receptors in the mammalian brain. GABAergic dysfunctions are associated with several neurological and psychiatrical disorders; therefore GABAA receptors represent interesting targets for the treatment of such diseases. GABAA receptors are heteromeric, ionotropic chloride channels, which are composed of five different subunits. Each subunit consists of four transmembrane domains (TM 1-4), which embed the receptor protein in the cell membrane and contain binding sites for several GABAA receptor ligands such as etomidate, lorecelzole and propofole. The aim of this thesis was to investigate the influence of six point mutations (β3T262S, β3N265S, β3T266A, β3M286W, β3F289S und α1M235W) within the transmembrane domains of the α1- and β3-subunit of the GABAA receptor on the modulation of GABA-induced chloride currents (IGABA) by the ligand BK06. Therefore, α1β3γ2S wildtype and respective point mutated receptors (α1β3T262Sγ2S, α1β3N265Sγ2S, α1β3T266Aγ2S, α1β3M286Wγ2S, α1β3F289Sγ2S and α1M235Wβ3γ2S) were expressed in Xenopus laevis oocytes and the modulation of IGABA by BK06 was analysed using the 2-microelectrode voltage-clamp technique and a fast perfusion system. My data indicate, that one amino acid in α1 (M235) and three amino acids in β3 (N265, M286, F289) are key determinants for the interaction between BK06 and the GABAA receptor: While BK06 modulated α1β3γ2S wildtype receptors potently and efficaciously (Emax = 694 ± 140 %; EC50 = 24,1 ± 8,8 μM), a significantly reduced IGABA modulation of the above mentioned point mutated receptors was observed (β3N265S: Emax = 118 ± 39 %; β3M286W: Emax = 35 ± 24 %; β3F289S: Emax = 248 ± 100 %; α1M235: Emax = 184 ± 17 %). Compared to that, the other two mutations (β3T262S und β3T266A) did not significantly affect the modulatory effect of BK06 indicating that these two threonine residues are not required for the interaction of BK06 with the receptor. Collectively, this work shows that single point mutations within the transmembrane domain of α1- and β3-GABAA receptor subunits significantly affect the modulation of IGABA by BK06. Further studies will show, whether additional amino acids in close proximity would also determine the modulatory effect of BK06 and therefore form a potential binding pocket on GABAA receptors.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Deutsch)
GABAA-Rezeptor Xenopus laevis-Oozyten 2-Mikroelektroden-Spannungsklemmtechnik Mutationsanalyse allosterische Modulation
Autor*innen
Katharina Keusch
Haupttitel (Deutsch)
Einfluss von verschiedenen Punktmutationen in den transmembranären Domänen der α- und β-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors auf die Modulation von I-GABA durch den Liganden BK06
Publikationsjahr
2014
Umfangsangabe
97 S.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Steffen Hering
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC12044472
Utheses ID
30392
Studienkennzahl
UA | 449 | | |
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