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Molecular mechanism of plectin-mediated IF network anchorage and mechanotransduction in skeletal muscle
Ilona Staszewska-Daca
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Gerhard Wiche
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30274.12230.947770-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Plectin ist ein sehr vielseitiges Protein von außerordentlicher Größe (> 500 kDa), das als mechanischer Linker zwischen dem Intermediärfilament (IF)-System und verschiedenen Zellstrukturen wirkt. Die Analyse von genetisch veränderten Mauslinien ergab, dass die vier großen Plectin Isoformen, die im Skelettmuskel exprimiert werden, das muskuläre Desmin-IF-Netzwerk gezielt zu Z-Scheiben (Isoform 1d, P1d) Costameren (P1f), zu Mitochondrien (P1b) und dem äußeren Kern/ER-Membransystem (P1) führen und dort verankern. Bisherige Studien in der Skelettmuskulatur zeigten, dass Plectin durch die Vernetzung von Organellen und unterschiedlichsten Zellstrukturen mit dem zytoskeletalen IF-System entscheidend für die Integrität von Skelettmuskelfasern ist. Plectin-Defizienz im Skelettmuskel führt zu verschiedenen pathologischen Veränderungen, einschließlich Zusammenbruch von Desmin IFs, Ablösen des Sarkolemma vom kontraktilen Apparat, Fehlausrichtung der Z-Scheiben sowie beeinträchtigte Funktion der Mitochondrien. Die Bedeutung von Plectin in der Aufrechterhaltung der richtigen Struktur und Funktion von Muskelgewebe wird durch die Tatsache unterstützt, dass verschiedene Mutationen im Plectin-Gen zu verschiedenen Krankheiten führen, die als Muskeldystrophie (MD) eingestuft werden. Eine kürzlich entdeckte Mutation im ersten kodierenden Exon von P1f verursacht Gliedergürtel-Muskeldystrophie vom Typ 2Q, was die Spezifität der Funktion von Plectin Isoformen bestätigt. In dieser Arbeit konzentrierte ich mich auf die Rolle von zwei bestimmten Isoformen von Plectin, nämlich P1 und P1d. Ich untersuchte deren spezifischen Targeting-Mechanismus zu den Membransystemen des Nukleus und des ER, bzw. an die Z-Scheibe. Im ersten Teil meiner Arbeit fragte ich, ob P1 durch spezifisches Verankern von IFs eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität von Myonuclei spielt. Um vergleichende Analysen von unterschiedlichen Kern- und IF-Netzwerkparametern durchzuführen, untersuchte ich die Skelettmuskelgewebe von Wildtyp-Mäusen sowie von einer Reihe von verschiedenen Mausmutantenlinien. Diese Mausstämme inkludierten P1-defiziente (P1-/-) und P1b-defiziente (P1b-/-) Mäuse, sowie Mäuse mit einem auf die quergestreifte Muskulatur beschränkten Plectin-knockout (MCK-Cre/cKO) und Desmin-null Mauslinien. P1b-/- und MCK-Cre/cKO Proben wurden in die Analyse eingeschlossen um die Isoform-Spezifität von P1-/- Phänotypen nachzuweisen, während Desmin-/- Muskelfasern mir ermöglichten zu beurteilen, ob das Fehlen von IF-Verankerung die Kernmorphologie ebenso beeinflussten wie der Mangel an IFs. Unter Verwendung verschiedener ultrastruktureller sowie Immunfluoreszenz-Techniken entdeckte ich, dass die Abwesenheit von P1 in Muskelfasern zu Veränderungen in der Kernmorphologie und zur Bildung von Desmin-positiven Aggregate in Kernnähe führt. Ich bemerkte, daß P1 für die Aufrechterhaltung und Regulation der ordnungsgemäßen Architektur und Funktionen der Kerne verantwortlich ist. Ich konnte zeigen, dass das Fehlen von P1 zu einem Muskel Phänotyp führt, der sehr ähnlich zu dem der Desmin-defizienten Myonuclei war, was Größe und Formänderungen sowie aberrante Positionierung der Kerne in Skelettmuskelfasern betraf. Die forcierte Expression der full-length-Version von P1 in Muskelfasern rettete die Kernmorphologie in einen Zustand vergleichbar mit den Wildtyp-Proben. Zudem zeigte Echtzeit-Mikroskopie von Kernen in immortalisierten Muskelfasern, dass P1-Defizienz die Mobilität der Kerne reduziert und als Folge davon die Mechanotransduktion verschlechtert. Zusätzlich, aufgrund von Änderungen in der Chromatin-Konformation, beeinflußt der Mangel an P1 die Expression von Proteinen, die an der Zellproliferation und Myogenese beteiligt sind. Schließlich offenbarten biochemische Untersuchungen, dass Veränderungen der Zellkernmorphologie aufgrund von P1-Defizienz im Muskel die Wechselwirkung von P1 mit dem nukleären Membran-assoziierten Protein Endophilin B2 involvieren könnte. Im zweiten Teil der Arbeit behandelte ich die Rolle von P1d in der Skelettmuskulatur. Bisherige Untersuchungen und vergleichende Studien mit P1d-/- und Wildtyp-Muskelfasern zeigte, dass P1d-Defizienz zur Bildung von Desmin-Aggregaten und zu fehlerhafter Ausrichtung der Z-Scheiben führt. Meine Beobachtungen zeigten, dass P1d-Mangel auch den Abstand zwischen benachbarten Z-Streifen in Skelettmu-skelfasern erhöht. Um mehr über die Funktion von P1d herauszufinden sowie um das spezifische Targeting von P1d zur Z-Scheibe zu definieren, führte ich verschiedene biochemische Studien durch um spezifische Bindungspartner von P1d zu identifizieren. Unter Verwendung von Hefe-Zwei-Hybrid-Screening und GST-Pulldown-Assays mit mehreren rekombinanten Proteine entdeckte ich, dass P1d die Z-Scheibenstruktur durch Wechselwirkung mit verschiedenen Z-Scheiben-assoziierten Proteinen, einschließlich dem Z-Scheiben-Kernprotein α-Actinin, stabilisiert. Darüber hinaus habe ich gezeigt, dass P1d mit den Hitzeschock-verwandten Hsc70 und Synaptopodin 2 (synpo2) interagiert, Proteine, die Bestandteile der sogenannten Chaperon-unterstützten selektiven Autophagie-(CASA) Maschinerie sind, ein kürzlich entdeckter Spannung-induzierter Proteinabbaukomplex der mit Z-Scheiben verbunden ist. Die Analysen von Skelettmuskelgewebe von P1d-/- und MCK-Cre/cKO Mäusen sowie von Plectin-null Muskelfasern, die mechanischem Strecken unterworfen wurden, belegten, dass P1d an der Regulation von CASA und dem ordnungsgemäßen Abbau von beschädigtem/fehl-gefaltetem Filamin C während der Muskelkontraktion beteiligt ist. Interessanterweise zeigten Desmin-defiziente Muskelfasern auch höhere Filamin C-Levels, was darauf hindeutet, dass der Phänotyp, der im P1d-/- Muskel beobachtet wird, auf unregelmäßig organisierte Z-Scheiben und mangelnden Verankerung von Desmin-IFs zurückzuführen ist. Diese Daten legen nahe, dass P1d-Defizienz zu Proteinaggregaten führt, die aufgrund einer Fehlfunktion des CASA nicht entfernt werden können. Infolgedessen akkumulieren Aggregate in der Zelle und destabilisieren die interne Struktur der Muskelfaser. Der Phänotyp wurde noch ausgeprägter, wenn P1d-/- Mäuse gezwungen wurden zu schwimmen, wo CASA aufgrund der intensiven Muskelermüdung fehlgefaltetes Filamin C, das in großen Clustern in der Muskelfaser akkumulierte, nicht entfernen konnte. Außerdem fand ich, dass Plectin-Defizienz zu erhöhten Spiegeln von Proteinen führt, die als Marker für Makroautophagie bekannt sind. Diese Befunde legen nahe, dass das Fehlen von Plectin als Stressfaktor für die Zelle wirkt, den Zusammenbruch von Protein-Homöostase auslöst und Makroautophagie-Signalwege induziert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Plectin nicht nur in der Verankerung von Desmin-IFs an verschiedenen zellulären Strukturen der Muskelfaser involviert ist, sondern auch eine entscheidende Rolle in Signalwegen spielt, welche die Mechanotransduktion im Muskel vermitteln.
Abstract
(Englisch)
Plectin is a highly versatile protein of extraordinary large size (>500 kDa) that acts as a mechanical linker between the intermediate filament (IF) system and various cellu-lar structures. The analysis of genetically altered mouse lines revealed that the four major plectin isoforms expressed in skeletal muscle are specifically targeting and an-choring the muscular (desmin) IF network to Z-disks (isoform 1d, P1d), costameres (P1f), mitochondria (P1b), and the outer nuclear/ER membrane system (P1). Pre-vious studies on skeletal muscle showed that plectin is crucial for skeletal myofiber integrity by interlinking organelles and various cellular structures with the cytoskeletal IF system. Plectin deficiency in skeletal muscle leads to several pathological altera-tions, including collapse of desmin IFs, detachment of the sarcolemma from the con-tractile apparatus, misalignment of the Z-disks, and compromised function of mito-chondria. The importance of plectin in maintaining the proper structure and function of muscle tissue is supported by the fact that various mutations in the plectin gene lead to several diseases classified as muscular dystrophies (MD). A recently discov-ered mutation in the first coding exon of P1f causes limb-girdle MD type 2Q (LGMD2Q) confirming the specificity of plectin isoform function. In this work, I focused on the role of two particular isoforms of plectin, namely P1 and P1d. I investigated their specific targeting mechanism to the nuclear/ER membrane system, and to the Z-disk, respectively. In the first part of my thesis, I asked whether P1 plays a role in maintaining the structural integrity of myonuclei by specifically an-choring them to IFs. In order to perform comparative analyses of several nuclear and IF network parameters, I examined skeletal muscle tissues derived from wild-type, and a series of different mouse mutants, including P1-deficient (P1-/-), P1b-deficient (P1b-/-), a striated muscle-restricted plectin knockout (MCK-Cre/cKO), and desmin-null mouse lines. P1b-/- and MCK-Cre/cKO specimens were included in the analysis to establish isoform-specificity of P1-/- phenotypes, whereas desmin-/- muscle fibers enabled me to assess whether the lack of IF anchorage was equally effective in alte-ring the nuclear morphology as was the deficiency of IFs per se. Using various ultra-structural and immunofluorescence techniques, I discovered that the absence of P1 in muscle fibers leads to alterations in nuclear morphology and formation of desmin-positive aggregates in the nuclear vicinity. I observed that P1 is responsible for main-taining and regulating proper nuclear architecture and functions. I could show that the lack of P1 leads to a muscular phenotype that was very similar to that of desmin-deficient myonuclei, as far as size and shape changes, as well as the aberrant po-sitioning of nuclei in skeletal muscle fibers were concerned. The forced expression of the full-length version of P1 in myotubes rescued the nuclear morphology to a state comparable with the wild-type specimens. Moreover, live imaging of nuclei in immor-talized myotubes showed that P1 deficiency reduces the mobility of nuclei and as a consequence impairs mechanotransduction. Additionally, due to changes in chroma-tin conformation, lack of P1 influences expression of proteins involved in cell prolife-ration and myogenesis. Finally, biochemical studies revealed that alterations of nu-clear morphology due to P1 deficiency in muscle might involve the interaction of P1 with the nuclear membrane-associated protein endophilin B2. In the second part of my thesis I addressed the role of P1d in skeletal muscle. Pre-vious analyses and comparative studies of P1d-/- and wild-type muscle fibers re-vealed that P1d deficiency leads to formation of desmin aggregates and misalign-ment of Z-disks. My observations showed that it also increases the distance between neighboring Z-striations in skeletal muscle fibers. To solve the function and define the specific targeting of P1d to the Z-disk, I performed various biochemical interaction studies to identify specific binding partners of P1d. Using yeast two-hybrid screening and GST pull-down assay with several recombinant proteins, I discovered that P1d stabilizes the Z-disk structure by interacting with several Z-disk-associated proteins, including the Z-disk core protein α-actinin. Furthermore, I showed that P1d interacts with heat shock cognate hsc70 and synaptopodin 2 (synpo2), proteins which are constituents of the so called chaperone-assisted selective autophagy (CASA) ma-chinery, a recently discovered tension-induced protein degradation complex asso-ciated with Z-disks. The analyses of skeletal muscle tissues derived from P1d-/- and MCK-Cre/cKO mice, as well as of immortalized plectin-null myotubes subjected to mechanical stretching, provided evidence that P1d is involved in the regulation of CASA and the proper degradation of damaged/misfolded filamin C during muscle contraction. Interestingly, desmin-/- muscle fibers also showed increased levels of filamin C, suggesting that the phenotype observed in P1d-/- muscle is due to irregular-ly organized Z-disks and the lack of desmin IF anchoring. These data suggest that P1d deficiency leads to protein aggregates that cannot be removed due to dysfunc-tion of CASA. As a consequence aggregates accumulate in the cell and destabilize the internal structure of the myofiber. The phenotype became even more severe when P1d-/- mice were subjected to forced swimming, where due to intensive muscle fatigue, CASA failed to remove unfolded filamin C accumulating in large clusters in the myofiber. In addition, I found that plectin deficiency leads to increased levels of proteins known as markers for macroautophagy. These findings suggest that the lack of plectin acts as a stress factor for the cell, triggers the disruption of protein homeo-stasis, and induces macroautophagy signaling. To summarize, this thesis demonstrates that plectin not only is involved in desmin IF anchorage at various cellular structures of myofiber, but also plays a crucial role in signaling pathways mediating mechanotransduction in muscle.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Plectin cytoskeleton muscular dystrophy cytolinkers mechanotransduction skeletal muscle structure
Schlagwörter
(Deutsch)
Plectin Zytoskelett Muskeldystrophie cytolinkers Mechanotransduktion Skelettmuskel-Struktur
Autor*innen
Ilona Staszewska-Daca
Haupttitel (Englisch)
Molecular mechanism of plectin-mediated IF network anchorage and mechanotransduction in skeletal muscle
Publikationsjahr
2015
Umfangsangabe
251 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Roland Foisner ,
John Eriksson
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC12230528
Utheses ID
32355
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1