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Feedback inhibition of STAT1 in chromatin and tonic modulation of STAT1 in the cytosol
Ivana Wiesauer
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
PhD-Studium (Doctor of Philosophy) (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Pavel Kovarik
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-21423.79520.351159-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Interferone (IFN) gehören zur Gruppe der Zytokine und tragen bei der Immunantwort eine grundlegende Rolle. IFN regulieren zelluläre Prozesse wie Proliferation, Zellüberleben und Entzündung und werden von den meisten Zelltypen als Kommunkationsmittel genützt. Die biologische Aktivität von Typ I (IFN-β) und Typ II (IFN-γ) IFN wird durch die Aktivierung des latent-cytoplasmatischen Transkriptionsfaktors STAT1 (signal transducer and activator of transcription) mittels der JAK/STAT Signaltransduktionskaskade gesteuert. STAT1 Dimere werden am IFN-Rezeptor mittels Tyrosin-Phosphorylierung aktiviert. Diese Modifikation bewirkt die Translokation von STAT1 in den Zellkern, die Bindung des Transkriptionfaktors an die DNA sowie die Aktivierung der Transkription von Zielgenen. Es ist bekannt, dass Tyrosin-Dephosphorylierung dazu führt, dass STAT1 seine Affinität zur DNA verliert und dadurch aus dem Zellkern ins Zytoplasma zurückkehrt. Dennoch ist nicht klar, ob und wie diese Prozesse reguliert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die negative Regulation der STAT1-Aktivität an zwei Schlüsselfunktionen, an der Promoterbindung beziehungsweise an der zytoplasmatischen Retention von STAT1 untersucht. Projekt I dieser Arbeit befasste sich mit der Inaktivierung von STAT1 in aus Knochenmark stammenden Makrophagen nach Stimulation mit Typ I IFN. Die Daten zeigten, dass beide Arten von STAT1-enthaltenden Komplexen, welche durch IFN-β aktiviert werden, das sind STAT1/STAT2 Heterodimere und STAT1 Homodimere, fortlaufende Transkription, jedoch nicht Translation für ihre Inaktivierung benötigten. Pharmakologische Hemmung der Transkription führte zu einer erhöhten Belegungsrate von STAT1 an Promotoren von Zielgenen, obwohl unter diesen Umständen die Aktivität der STAT1 Tyrosin-Phosphatase nicht gestört wurde. Dies stimmte mit der verlängerten Promoterbelegung von STAT1β, einer transkriptionell weniger aktiven STAT1 Isoform, überein. Wesentlich ist auch das Ergebnis, dass chemische Inhibition der Tyrosine Phosphatase nicht zur Verminderung der STAT1 Belegung an Zielpromotoren führte. Zusammengefasst zeigen die hier gesammelten Daten, dass Inaktivierung von STAT1 durch den Transkriptionsprozess reguliert wird. Die Ergebnisse implizieren, dass nach erfolgreicher Aktivierung der Transkription und der Assemblierung von Transkriptionskomplexen, die Transkriptionsmaschinerie eine Minderung der Menge an promotergebundenem STAT1 herbeiführt. Dieser Mechanismus verhindert die konstitutive Aktivierung von STAT1 trotz eines bestehenden IFN-Reizes am Rezeptor. Da ähnliche Daten für STAT2 und STAT3 erhoben wurden, weist dies darauf hin, dass diese Art der Regulation unter den Proteinen der STAT-Familie konserviert sein könnte. Projekt II dieser Arbeit untersucht wie sich ein verändertes Verhältnis zwischen STAT1 und STAT2 auf die zelluläre Antwort auf IFN auswirken kann. Diese Projekt basiert auf vorangehenden Beobachtungen im Labor, die implizierten, dass unverhältnismäßig höhere STAT2 Mengen zur negativen Regulation von STAT1 Homodimeren führen könnten. Um den Einfluss von niedrigen im Vergleich zu hohen STAT1 Mengen auf die Expression von Mx2 und Irf1 zu untersuchen, wurde der zelluläre Gehalt von STAT1 titriert und anschließend die IFN-induzierte Genexpression gemessen. Um den Effekt von einem STAT2 Überschuss zu untersuchen, wurde die Überexpression von STAT2 mit Luciferase Reporter Assays kombiniert. Die so erhaltenen Daten zeigen, dass ein niedriges STAT1:STAT2 Verhältnis dazu führt, dass Gene, die durch STAT1 Homodimere gesteuert werden, negativ reguliert werden. Daher unterstützen diese Daten die Hypothese, dass nicht phosphoryliertes STAT2 STAT1 im Zytosol zurückhält und dadurch die Menge der STAT1 Homodimere, welche für die Aktivierung verfügbar sind, reduziert. Diese tonische Modulierung der STAT1 Homodimermengen hängt vom STAT1:STAT2 Verhältnis ab.
Abstract
(Englisch)
Interferons (IFNs) are cytokines having fundamental functions in immune responses. IFNs regulate cellular processes such as proliferation, cell survival and inflammation and are used as a means of communication by most cell types. Biological activity of type I (IFN-β) and type II (IFN-γ) IFNs is conferred by activation of the latent cytoplasmic transcription factor STAT1 (signal transducer and activator of transcription) via the JAK/STAT pathway. STAT1 dimers are activated at the IFN receptor via tyrosine phosphorylation. This modification mediates nuclear translocation and DNA-binding of STAT1 resulting in transcriptional activation of target genes. It is well established that tyrosine dephosphorylation causes STAT1 to lose its DNA binding activity and relocate to the cytosol, but it remains to be elucidated whether and how these process are regulated. This PhD thesis investigated negative regulation of STAT1 activity at two key steps, namely promoter binding and cytoplasmic retention. Project I of this thesis focussed on STAT1 inactivation in response to type I IFNs in murine bone marrow-derived macrophages (BMDMs). The data demonstrated that both types of STAT1-containing dimers activated by IFN-β, STAT1/STAT2 heterodimers and STAT1 homodimers, require ongoing transcription but not translation in order to be inactivated. Pharmacological blockage of transcription resulted in increased occupancy of STAT1 at target promoters although the activity of STAT1 tyrosine phosphatase was not perturbed under these conditions. Consistently, STAT1β, the transcriptionally less active STAT1 isoform, exhibited a prolonged promoter occupancy. Importantly, chemical inhibition of tyrosine phosphatases did not prevent STAT1 occupancy to decrease with time. Collectively, the data show that inactivation of STAT1 is regulated by the transcription process. The results imply that after successful activation of transcription and assembly of the transcriptional complexes, the transcription machinery decreases the amount of STAT1 at the promoter. This mechanism ensures that constitutive activation of STAT1 is prevented in spite of the presence of the stimulus. Similar data were obtained also for STAT2 and STAT3 suggesting that this mode of regulation is conserved among STATs. Project II of this thesis examines how changing STAT1:STAT2 ratios in the cell impinge on IFN responses. The project is based on previous observations in the lab which suggested that higher than stoichiometric levels of STAT2 might negatively regulate STAT1 homodimers. To assess the impact of low versus high STAT1 amounts on expression of Mx2 and Irf1, cellular STAT1 amounts were titrated and IFN-induced gene expression was quantitated. To assess the effect of excessive STAT2 protein levels, overexpression of STAT2 together with luciferase reporter assays were used. In combination, the data obtained show that low STAT1:STAT2 ratios negatively regulate transcription driven by STAT1 homodimers. Thus, the data support the hypothesis that unphosphorylated STAT2 sequesters STAT1 in the cytosol and thereby reduces the amounts of STAT1 homodimers available for activation. This tonic modulation of the levels of STAT1 homodimers is dependent on the cellular STAT1:STAT2 protein ratios.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Interferon STAT1 Transcription Feedback inhibition
Schlagwörter
(Deutsch)
Interferon STAT1 Transkription rückgekoppelte Inhibition
Autor*innen
Ivana Wiesauer
Haupttitel (Englisch)
Feedback inhibition of STAT1 in chromatin and tonic modulation of STAT1 in the cytosol
Paralleltitel (Deutsch)
Rückgekoppelte Inhibition von STAT1 im Chromatin und tonische Modulation von STAT1 im Zytosol
Publikationsjahr
2016
Umfangsangabe
96 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Roland Lang ,
Emilio Casanova
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC13337730
Utheses ID
38531
Studienkennzahl
UA | 094 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1