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Identification and characterization of novel regulatory RNAs in Pseudomonas aeruginosa during anaerobiosis
Muralidhar Tata
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie, DK: RNA Biology)
Betreuer*in
Udo Bläsi
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30905.46609.819559-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Im letzten Jahrzehnt wurden eine stetig steigende Anzahl von nicht-kodierenden Ribonukleinsäuren (ncRNA´s) in allen drei Domänen des Lebens beschrieben und als neue Genregulatoren klassifiziert. In Bakterien sind viele dieser ncRNA an der Regulation von physiologischen Prozessen beteiligt. In pathogenen Bakterien, wie z.B. Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae oder Staphylococcus aureus regulieren diese RNA´s unter anderem auch die Expression von Virulenzgenen. Diese regulatorischen RNA interagieren durch Basenpaarung entweder in cis oder trans mit den Ziel- RNA´s, oder durch Bindung an Ziel-Proteine bei gleichzeitiger Modifizierung derer Wirkungsweise. Trotz steigender Zahl an identifizierten regulatorischen RNA´s in Bakterien ist die genaue biologische Funktion der meisten weitgehend unbekannt. Im ersten Teil dieser Studie wurden vergleichende Transkriptom Analysen basierend auf gesamt RNA Seqeuenzierung (RNA-Seq) eines klinischen Isolats von Pseudomonas aeruginosa PA14 durchgeführt. Hiermit sollten differentiell regulierte Abläufe bei der anoxischen Biofilm-Formation nachgewiesen, sowie Erkenntnisse in Bezug auf Toleranz gegenüber verschiedenen Antibiotika erhalten werden. PA14 Kulturen wurden hierfür in synthetischem „zystischem Fibrose Medium“ unter planktonischem aeroben Wachstum (OD600 =2,0), bzw. 30 Minuten nach Übergang von aerobem zu anaerobem Wachstum (A-30), oder nach 96 stündigem anaeroben Wachstum unter Biofilm Ausbildung (B-96) untersucht. Hierbei zeigte sich vor allem eine erhöhte Genexpression im Schwefel-Stoffwechsel bei B-96 Kulturen im Vergleich zu A-30 Kulturen. Ebenso wurden, basierend auf der durchgeführten Transkriptom Analyse, verschiedene Transposon Mutanten untersucht und hierbei weitere, bisher nicht bekannte Faktoren bei der anoxische Biofilm-Formation aufgezeigt. In B-96 Kulturen wurde eine Reduktion der oprD Transkription bei gleichzeitiger Anhäufung von Transkripten des mexCD-oprJ Operons festgestellt. Dadurch kann eine erhöhte Toleranz gegenüber dem Antibiotikum Meropenem und weiteren Antibiotika, welche durch die MexCD-OprD Efflux Pumpe ausgeschleust werden, erklärt werden. OprI ist ein potentielles „Target“ von kationischen antimikrobiellen Peptiden, wie SMAP-29. Transkriptom und darauf folgende Northern-Blot Analysen zeigten eine stark reduzierte Menge an oprI Transkript in B-96 Kulturen. Eine hergestellte PA14ΔoprI Mutante zeigte im Vergleich zum Wildtyp allerdings keine veränderte Sensibilität gegenüber SMAP-29, wodurch OprI, zumindest unter den getesteten Bedingungen als „Target“ von diesem kationischen antimikrobiellen Peptid in PA14 auszuschliessen ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollten neue regulatorische RNA´s unter anaeroben Bedingungen identifiziert werden. Neben bereits beschriebenen RNA´s konnten weitere neue, differenziell exprimierte und regulierte potentielle kleine RNA´s (sRNA´s) gefunden werden. Eine dieser RNA´s, PaiI, sowie eine antisense RNA (asRNA) SPA0115 wurden detailierter untersucht. PaiI wird unter anaeroben Bedingungen in Gegenwart von Nitrat, abhängig vom 2-Komponenten System NarXL exprimiert. PaiI wird unmittelbar nach Sauerstoff Entzug und in Anerobiose exprimiert und in Anwesenheit von Sauerstoff degradiert. PaiI ist weiters für eine effiziente Denitrifikation bei der Umwandlung von Nitrit zu Stickstoffmonoxid notwendig. In Abwesenheit von PaiI erfolgt ein vermindertes Wachstum in Glukose Medium, in Übereinstimmung mit einer verringerten Aufnahme dieser C-Quelle unter diesen Bedingungen. Die Bedeutung von PaiI für anaerobes Wachstum wird weiters belegt durch ein verringertes Wachstum in transplantierten Maustumoren. Das für die untersuchte antisense RNA kodierende Gen spa0115 liegt im 3´untranslatierten Bereich des offenen Leserahmens von PA2759 auf dem gegenüberliegenden DNA-Strang. Die Deletion von spa0115 resultierte in einem veringerten anaeroben Wachstum in Minimalmedium supplementiert mit Succinat. Die Bedeutung von SPA0115 für anaerobes Wachstum wird weiters bestätigt durch ein verringertes Wachstum in Sauertoff reduzierten oder anaeroben Bereichen in transplantierten Maustumoren. Eine RNA-Seq basierte Transkriptomanalyse von PAOI und PAOIΔspa0115 zeigte, dass die Mehrheit der differentiell regulierten Gene der Kontrolle des transkriptionalen Regulators AmrZ unterliegt. Anschliessende GRIL-Seq Analysen zeigten, dass SPA0155 als anti-sense RNA mit der 3´UTR des PA2759 Transkripts interagiert, welches für ein mögliches Lipoprotein kodiert. Diese Erkenntnisse werden in einer Arbeitshypothese diskutiert, worin SPA0115 einen Einfluss auf die gebildete Menge dieses Lipoproteins hat. Dies wiederum könnte einen Einfluss auf die Funktionsweise des extra-cytoplasmatischen Sigma Faktors AlgU haben, und folglich auf die AlgU abhängigen expression von amrZ.
Abstract
(Englisch)
During the last decade an increasing number of RNAs have been discovered in all kingdoms of life that were recognized as a novel class of gene regulators. In Bacteria, many of these RNAs play a role in regulating a wide range of physiological processes. In pathogenic Bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae and Staphylococcus aureus, regulatory RNAs are also known to regulate virulence gene expression. These RNA regulators can either act in cis or trans by base-pairing with target mRNA or by binding to and modulating the function of target proteins. Although the number of regulatory RNAs across bacterial species continues to rise, the function for most of these sRNAs remains to be determined. In the first part of the study a RNASeq based comparative RNA profiling of the clinical isolate PA14 cultured in synthetic cystic fibrosis medium was performed after planktonic growth (OD600 = 2.0; P), 30 min after shift to anaerobiosis (A-30) and after anaerobic biofilm growth for 96 h (B-96) with the aim to reveal differentially regulated functions impacting on sustained anoxic biofilm formation as well as on tolerance towards different antibiotics. Most notably, functions involved in sulfur metabolism were found to be up-regulated in B-96 cells when compared to A-30 cells. Based on the transcriptome studies a set of transposon mutants were screened, which revealed novel functions involved in anoxic biofilm growth. In addition, these studies revealed a decreased and an increased abundance of the oprD and the mexCD-oprJ operon transcripts, respectively, in B-96 cells, which may explain their increased tolerance towards meropenem and to antibiotics that are expelled by the MexCD-OprD efflux pump. The OprI protein has been implicated as a target for cationic antimicrobial peptides, such as SMAP-29. The transcriptome and subsequent Northern-blot analyses showed that the abundance of the oprI transcript encoding the OprI protein is strongly decreased in B-96 cells. However, follow up studies revealed that the susceptibility of a constructed PA14ΔoprI mutant towards SMAP-29 was indistinguishable from the parental wild-type strain, which questions OprI as a target for this antimicrobial peptide in strain PA14. In the second part of the study we aimed at identifying novel regulatory sRNAs induced during anaerobiosis. Among already known and new differentially abundant sRNA candidates this survey revealed a novel sRNA PaiI and an asRNA SPA0115. Our results showed that PaiI is anaerobically induced in the presence of nitrate and depends on the two-component system NarXL. PaiI is induced rapidly during anaerobiosis and is rapidly degraded in the presence of oxygen. Our studies further revealed that PaiI is required for efficient denitrification affecting the conversion of nitrite to nitric oxide. In the absence of PaiI anaerobic growth was impaired on glucose, which can be reconciled with a decreased uptake of the carbon source under these conditions. The importance of PaiII for anaerobic growth is further underlined by the observation that a sRNA deletion mutant was impaired in growth in murine tumors. The antisense RNA encoding gene spa0115 is transcribed from the opposite strand in the 3´ untranslated region (UTR) of ORF PA2759 in an ANR dependent manner. Deletion of spa0115 resulted in reduced anaerobic growth in minimal medium supplemented with succinate. The importance of SPA0115 for anaerobic growth was corroborated by the observation that a PAO1 spa0115 deletion mutant was impaired in growth in transplanted murine tumors that consist of hypoxic/anaerobic areas. A RNA-Seq based comparative transcriptome analyses of PAO1 and PAO1Δspa0115 revealed that the majority of differentially regulated genes are controlled by the transcriptional regulator AmrZ. Moreover, a subsequent GRIL-Seq analysis indicated that SPA0115 acts as an antisense RNA by interacting with the 3´ UTR of the PA2759 transcripts, which encodes a putative lipoprotein. These findings are discussed in terms of a working model wherein SPA0115 affects the abundance of the lipoprotein. This in turn might impact on the functionality of the extra cytoplasmic sigma factor AlgU, and thus AlgU dependent amrZ expression.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Deutsch)
nicht-kodierende Ribonukleinsäuren (ncRNA´s) Pseudomonas aeruginosa
Autor*innen
Muralidhar Tata
Haupttitel (Englisch)
Identification and characterization of novel regulatory RNAs in Pseudomonas aeruginosa during anaerobiosis
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
161 Seiten : Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Vladimir Kaberdin ,
Boris Görke
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC14533880
Utheses ID
44820
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1