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Cannabis sativa L.: in vitro Micropropagation

Christian Johannes Leeb

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)

Masterstudium Verhaltens-, Neuro- und Kognitionsbiologie

Betreuer*in

Sergey Zotchev

Mitbetreuer*in

Andrea Kodym

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DOI

10.25365/thesis.51202

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-13169.65598.292959-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Cannabis sativa L. (Cannabaceae) dient der Menschheit seit hunderten von Jahren als Quelle von Nahrung, Fasern und Medizin und stellt geringe Anforderungen an Boden und Klima. Die geringen Anforderungen an die Kulturbedingungen, die wirtschaftliche Bedeutung und die intensive Beforschung von C. sativa machen diese Pflanze zu einem geeigneten Modellorganismus. Die in vitro Micropropagation mit ihren vielen Verfahren eignet sich für Grundlagenforschung, Züchtung, Erhaltung und Vermehrung von genetischen Ressourcen. Darüber hinaus könnten auch informationsverarbeitende Prozesse innerhalb der Pflanze untersucht werden. Die Zielsetzungen der vorliegenden Arbeit sind Vorteile und Möglichkeiten einerseits der in vitro Micropropagation, als keimfreie Kulturmethode unter kontrollierten Bedingungen, aufzuzeigen. Andererseits werden Vorteile und Möglichkeiten der Pflanze Cannabis sativa als Nutzpflanze und Modellorganismus beschrieben. Weiters werden verschiedene Verfahren der in vitro Micropropagation in Bezug auf C. sativa angewendet und weiterentwickelt, um sowohl der Forschung als auch der Industrie befriedigende Lösungen zu bieten. Obwohl C. sativa unter konventionellen gärtnerischen Bedingungen sehr einfach zu kultivieren ist, gestaltet sich die in vitro Micropropagation als schwierig, weil die Vermehrungsraten niedrig sind. Meistens wird in der Literatur das von Murashige & Skoog 1962 entwickelte MS-Medium als Kulturmedium verwendet, ohne Alternativen zu testen. Zur Verbesserung der Kulturbedingungen liegt das Hauptaugenmerk meist auf Konzentration und Art der Wuchsstoffe. Es wurden jedoch auch mit Erfolg Untersuchungen von Casano und Grassi durchgeführt, bei denen Medien verwendet wurden, welche den Bedürfnissen von C. sativa weit besser entsprechen. Eine weitere Möglichkeit die Micropropagation von C. sativa zu verbessern stellt die von Kozai beschriebene photoautotrophe in vitro Kultur dar. Sie unterscheidet sich von den üblichen Verfahren durch die Abwesenheit von organischen Stoffen, wie Sucrose und Vitaminen im Medium und der Verfügbarkeit von ausreichend Kohlendioxid und Licht für die Photosynthese. In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal EU-zertifizierte Industriehanfsorten in vitro kultiviert. Diese Sorten eignen sich zur Erzeugung von Nahrung, Fasern und Cannabinoiden wie zum Beispiel Cannabidiol, unterliegen jedoch aufgrund ihres extrem niedrigen Tetrahydrocannabinol-Gehaltes keinen strengen gesetzlichen Regelungen. Im Vergleich von zehn verschiedenen Medien unter konventionellen Micropropagation Bedingungen wies das MS-Medium mit 3 % (w/v) Sucrose (Suc.), MS-Vitaminen, 0,5 g/L Aktivkohle und 2 µmol/L meta-Topolin (m-T), publiziert von Lata et al. 2016, die größten Zuwächse an Höhe (19 mm/10 Tage) und Anzahl an Nodien (1,4/10 Tage) auf. Ein ähnlich gutes Ergebnis wies das von Lata et al. 2009 veröffentlichte MS-Medium auf, welches sich vom vorherigen nur durch den verwendeten Wuchsstoff und das Fehlen von Aktivkohle unterschied. Dieses enthielt 0,5 µmol/L Thidiazuron und zeigte ebenfalls gute Zuwächse an Höhe (15 mm/10 Tage) und der Anzahl von Nodien (1,3/10 Tage). Die Qualität der Pflanzen auf diesen Medien war nicht gut, weil diese einen abnormalen Habitus aufwiesen. Es wurden auch keine Wurzel gebildet und so muss vor der Akklimatisierung Wurzelbildung initiiert werden. Medien ohne MS-Salze und MS-Vitamine zeigten, dass MS-Nährsalze, bei der Verwendung von Alternativen, und Vitaminzusätze nicht zwingend notwendig für die in vitro Micropropagation sind. Das Medium mit handelsüblichem Pflanzendünger für die Hydrokultur (AB-Medium) mit 1 % (w/v) Suc. und 2 µmol/L m-T zeigte einen etwas größeren Höhenzuwachs (10 mm/10 Tagen) als das gleiche Medium mit zusätzlichen MS-Vitaminen (9 mm / 10 Tagen). Das AB-Medium, auf dem als einziges Wurzeln gebildet wurden, enthielt lediglich Dünger in halber Konzentration und musste somit zu einer photoautotrophen Kultur führen. Die Zuwächse an Höhe (5 mm/10 Tage) sind zwar nicht hervorragend, jedoch bildeten 39 % der Individuen Wurzeln aus und zeigten einen gesunden Wuchs, was für die Qualität dieser Kulturen spricht. Weiters wurden Kulturmedien in Kulturgefäßen ohne (Normal) und mit erhöhter Möglichkeit zur Photosynthese (Photo+) durch erhöhte Beleuchtung (Normal: ~59 µmol/m²s, photo+: ~161 µmol/m²s) und Gasaustausch mit der Umgebung, mittels permeabler Verschlüsse, verglichen. Im Vorversuch mit AB-Medien zeigte sich eine deutliche Überlegenheit der Photo+ Bedingungen. Im Hauptversuch wurden größere Kulturgefäße verwendet. Es wurden dabei vier verschiedene MS-Medien mit und ohne Sucrose, m-T und MS-Vit und ein AB-Medium ohne Sucrose, m-T und MS-Vit verwendet. Dabei zeigte die Photo+ Bedingung nur bei Abwesenheit von Sucrose im Medium (photoautotroph) einen größeren Zuwachs an Höhe und Anzahl der Nodien. In Anwesenheit von Sucrose (mixotroph) zeigte die normale Bedingung größere Zuwächse. Die Sterblichkeit der mixotrophen Kulturen lag zwischen 0 und 65 %. Die Sterblichkeit der photoautotrophen Kulturen war auf dem MS-Medium (85 % tot) deutlich höher als auf dem AB-Medium (45 % tot). Das deutet darauf hin, dass MS-Medien für die photoautotrophe in vitro Micropropagation von C. sativa nicht geeignet sind. In einem anderen Experiment zeigten oberflächlich sterilisierte Sprossspitzen auf porösen Medien in aseptischen Kulturgefäßen mit ausreichend Licht (85 µmol/m²s) und Luftaustausch durch Zwangsbelüftung, gutes Wachstum und Wurzelbildung. Im Vergleich zu gelierten Medien bietet der Einsatz poröser Sucrose-freier Medien große Vorteile bei der Wurzelbildung. In diesem Experiment zeigten die Pflanzen auf Vermiculit, Steinwolle und Blumenerde, alle in AB-Nährlösung getränkt, gutes Wachstum und Wurzelbildung. Im Gegensatz dazu wurde auf dem gelierten Medium kein gutes Wachstum und keine Wurzelbildung beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass gelierte Medien die Wurzelbildung und ein gesundes Wachstum von C. sativa hemmen. Zur oberflächlichen Sterilisation von Samen erwies sich die Methode mit 0,5 % (w/v) Natriumhypochlorid (NaOCl), zehn Minuten Einwirkzeit und viermal 10-minütigem Waschen, wobei 79 % der Samen steril und gekeimt waren, als geeignete Methode. Für die oberflächliche Sterilisation von frischen Pflanzenteilen zeigte sich die Methode mit 0,5 % (w/v) NaOCl, 20 Minuten Einwirkzeit und dreimal 10-minütigem Waschen, wobei 86 % der Explantate steril waren, als geeignet. Die Blütenbildung war ein Problem, weil es bei der klonalen Vermehrung, also auch bei der in vitro Micropropagation, unabdinglich ist, dass sich die C. sativa Pflanzen im vegetativen Stadium befinden und nicht in das reproduktive Stadium übergehen. Bei dem C. sativa Wildtyp konnte eine Photoperiode von 18 Stunden pro Tag, wie es bei einer Kurztagpflanze zu erwarten ist, die Blütenbildung verhindern. Bei den EU-zertifizierten Nutzhanfsorten Futura 75, Santhica 27, Fedora 17, Finola und der Sorte aus dem Arzneigarten gelang die Unterdrückung der Blüte gar nicht und bei der F2-Generation von Felina 32 nur bedingt. Um diese Sorten klonal vermehren zu können, bei denen die Photoperiode das Blühen nur verzögert und nicht verhindert, müssen zuerst Verfahren entwickelt werden, um die Blütenbildung zuverlässig verhindern zu können. Dies könnte zum Beispiel durch den Einsatz von Wuchsstoffen erreicht werden. Zur Erhaltung der sterilen Kulturen wurden Sämlinge ständig weiter subkultiviert. Eine Lagerung von keimfreien Sämlingen [25 ± 1 °C, ~55 µmol/(m²s), 16h/d] über 100 Tage stellte keine Probleme dar und es konnten mehrere Nodien für die Subkultur erhalten werden. Für die längerfristige Konservierung von keimfreien Kulturen wurden diese bei 8 °C [~35 µmol/(m²s), 18h/d] für 200 Tage gelagert, wobei 76 % der Individuen überlebten. Durch die Ermittlung und anschließende Lagerung der Kulturen nahe dem Lichtkompensationspunkt ließe sich dieses Verfahren weiter optimieren. Zusammenfassend waren photoautotrophe Kulturbedingungen für die in vitro Micropropagation von C. sativa am besten geeignet und sollten weiter untersucht werden. Dabei müssen die Pflanzen mit ausreichend Kohlendioxid und Licht für die Photosynthese versorgt werden. Auf porösen Sucrose-freien Kulturmedien wurden in allen Fällen Wurzeln gebildet, was zu einer guten Nährstoffaufnahme und einem gesunden Wuchs führte. Die Zusammensetzung von MS-Medien ist nicht an die Anforderungen von C. sativa angepasst, wohingegen Medien mit handelsüblichem Dünger für die Hydrokultur ohne MS-Vitaminen, zu einem guten Wachstum und zu guter Pflanzenqualität führten. Für die klonale Vermehrung von C. sativa muss die Blütenbildung unterdrückt werden. Für die Erhaltung von Pathogen-freien Kulturen können diese laufend subkultiviert oder bei niedrigen Temperaturen und wenig Licht gelagert werden.

Abstract

(Englisch)

Cannabis sativa L. (Cannabaceae) has served humanity for hundreds of years as a source of food, fibre and medicine and it has low requirements to soil and climate. The low demands on culture conditions, the economic importance and the intensive research of C. sativa make it a suitable model organism. In vitro propagation with its many techniques is suitable for basic research, breeding and preservation and multiplication of genetic resources. In addition, information processing within the plant could also be investigated. The aim of the present work is to show the possibilities of in vitro micropropagation as a sterile culture method under controlled conditions on the one hand and the advantages of the plant Cannabis sativa, as crop plant and model organism on the other. Furthermore, in vitro micropropagation including under photoautotrophic conditions were applied to C. sativa and further developed with the aim to provide satisfying solutions for both, research and industry. Although C. sativa is very easy to cultivate under conventional horticultural conditions, in vitro micropropagation is difficult because conventional in vitro conditions result in low micropropagation rates and retarded growth. In the literature mostly, Murashige & Skoog based media (MS-media) are used as culture media in nearly airtight vessels, without testing alternatives. When attempting to improve the culture conditions, the focus is mostly placed on the concentration and type of growth regulators. However, Casano and Grassi successfully developed media that performed better than MS-media according to the in vitro micropropagation of C. sativa. A further possibility to improve the micropropagation of C. sativa is the in vitro photoautotrophic culture described by Kozai. It differs from the conventional methods in the absence of organic substances such as sucrose and vitamins in the medium and the availability of sufficient carbon dioxide and light for photosynthesis. In this work, EU-certified hemp varieties were cultivated in vitro for the first time. These varieties are suitable to produce food, fibres and cannabinoids such as cannabidiol, but are not subject to strict legal regulations because of their extremely low tetrahydrocannabinol content. Comparing ten media under conventional micropropagation conditions, the MS-medium containing 3 % (w/v) sucrose (suc.), MS-vitamins, 0.5 g/L activated carbon and 2 µmol/L meta-Topolin (m-T), published by Lata et al. 2016, resulted in the largest increase in height (19 mm/10 days) and number of nodes (1.4 /10d). A similar result was achieved on the medium published by Lata et al. 2009, which is only different from the previous by the used growth regulator and the absence of activated carbon. It contained 0.5 µmol/L thidiazuron and showed good increases in height (15 mm/10d) and number of nodes (1.3 /10d). However, on both media the quality of plants was not good, because the habitus was abnormal. Also, no roots were formed and so roots must be initiated before acclimatisation. Media with commercial fertilizer for hydroponic culture instead of MS-salts and without MS-vitamins showed that for in vitro micropropagation MS nutrient salts are not necessary, if alternatives are used, and vitamin supplements are not necessary at all. The medium with commercial plant fertilizer for hydroponic culture (AB-medium) with 1 % (w/v) suc. and 2 µmol/L m-T showed a slightly greater increase in height (10 mm/10d) than the same medium with additional MS-vitamins (9 mm/ 10d). The AB-medium, which contained only fertilizer at half concentration, and therefore had to result in a photoautotrophic culture, was the only one on which roots were formed. The increase in height (5 mm/10d) was not excellent, but 39 % of the individuals formed roots and showed healthy growth, which stands for the quality of these cultures. Furthermore, culture media in culture vessels without (regular) and with increased possibility for photosynthesis (photo+) by increased illuminance (regular: ~59 µmol/m²s, photo+: ~161 µmol/m²s) and gas exchange with the environment, by using permeable caps, were compared. The preliminary experiment with AB-media, showed a clear superiority of the photo+ condition. In the main experiment larger baby food jars were used as culture vessels. Furthermore, four different MS-media with and without sucrose, m-T and MS-vit, and one AB-medium without m-T, sucrose and vitamins were used. The photo+ condition showed only in the absence of sucrose in the medium (photoautotrophic) a larger increase in height and number of nodes, compared to the regular condition. In the presence of sucrose (mixotroph), the plants under regular condition showed greater gains, compared to that under photo+ condition. The mortality of the mixotrophic cultures was 0 to 65 %. The mortality of the photoautotrophic cultures was higher on MS-medium (85 % dead) than on the AB-medium (45 % dead). This indicates that MS-media are not suitable for photoautotrophic in vitro Micropropagation of C. sativa. In another experiment superficial sterilized shoot tips on porous media in aseptic culture vessels with enough light (85 µmol/m²s) and air exchange, through forced ventilation, showed good growth and rooting. Compared with gelled media, the use of porous sucrose-free media offers great advantages in the formation of roots. In this experiment the plants on vermiculite, rock wool and potting soil, all soaked in AB-nutrient solution, showed excellent growth and resulted in 100 % rooting. In contrast to the plants on the gelled medium on which no good growth and no rooting was observed. This indicates that gelled media inhibits root formation and healthy growth in C. sativa. For sterilization of seeds the method with 0.5 % (w/v) sodium hypochlorite (NaOCl), 10 minutes exposure time and four times 10 minutes washing, proved to be a suitable method with 79 % of sterile and germinated seeds. For superficial sterilization of fresh parts of the plant, the method with 0.5 % (w/v) NaOCl, 20 minutes exposure time and three times 10 minutes washing, with 86 % of sterile explants was suitable. Flower formation was a problem, because for clonal propagation, including micropropagation, it is essential that the plants are in vegetative state and do not pass into reproductive state. With the C. sativa wild type, a photoperiod of 18 hours per day prevented flower formation, as expected in short day plants. This was not the case with EU-certified hemp varieties Futura 75, Santhica 27, Fedora 17, Finola and those collected from medical garden and only partially with the F2 generation of Felina 32. To be able to multiply these varieties in which the photoperiod can only delay but not prevent flowering, through clonal propagation, methods must be developed to reliably prevent flower formation. For example, this could be achieved using growth regulators. To maintain sterile cultures seedlings were continuously subcultured. Storage of aseptic seedlings [25 ± 1 °C, ~55 µmol/(m²s), 16h/d] over 100 days was not a problem and from each seedling multiple nodes could be obtained for further subculture. For long-term preservation of pathogen-free cultures, these were stored at 8 °C [~35 µmol/(m²s), 18h/d] for 200 days. 76 % of the individuals survived the long-term storage. By determining the light compensation point and storing the plants at this combination of temperature and illuminance, the long-term storage could be further optimized. In conclusion, photoautotrophic culture conditions were best suited for the in vitro micropropagation of C. sativa and should be further investigated. Therefore, the plants must be provided with sufficient carbon dioxide and light for photosynthesis. On porous sucrose-free culture media roots were formed in all cases. This resulted in good nutrient uptake and healthy growth. The composition of MS-media is not adapted to the requirements of C. sativa but media prepared with a commercial fertilizer for hydroponic culture without MS-vitamins resulted in good growth and plant quality. For clonal multiplication of C. sativa, flower formation must be prevented. To maintain pathogen-free cultures, they can be continuously subcultured or stored at low temperatures and low light.

Autor*innen

Christian Johannes Leeb

Haupttitel (Deutsch)

Cannabis sativa L.: in vitro Micropropagation

Paralleltitel (Englisch)

Cannabis sativa L. : in vitro micropropagation

Publikationsjahr

2018

Umfangsangabe

III, 65 Seiten : Illustrationen, Diagramme

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Sergey Zotchev

Klassifikationen

42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,

42 Biologie > 42.41 Pflanzenphysiologie ,

44 Medizin > 44.41 Pharmazeutische Biologie

AC Nummer

AC15015361

Utheses ID

45225

Studienkennzahl

UA | 066 | 878 | |

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Schlagwörter