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Development of an isobaric-tag based quantitative cross-linking mass spectrometry method
Christian Stieger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Christopher Gerner
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.51612
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17733.25795.663869-5
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
In den vergangenen Jahrzehnten hat sich Cross-Linking Massenspektrometrie als wichtige Ergänzung in der Proteom-Forschung etabliert. Im Vergleich zu klassischen Proteomics-Experimenten liefert diese Methode nicht nur Informationen über Präsenz und Quantität eines Proteins oder Peptids, sondern erlaubt darüberhinaus Rückschlüsse auf dessen dreidimensonale Struktur und ist damit auch ein nützliches Werkzeug für Strukturbiologen. Um tiefere Einblicke in die Dynamik von Proteinen zu erlangen, gibt es zahlreiche Ansätze um quantitative Methoden mit Cross-Linking Massenspektrometrie zu kombinieren. In dieser Arbeit wird eine neue und einfache Methode zur Quantifizierung von gecross-linkten Peptiden mit Hilfe von isobarischen Markierungsreagenzien zur Quantifizierung auf der MS2-Ebene beschrieben. Im Vergleich zu bisher beschriebenen Methoden erlaubt sie „Multiplexing“ und benötigt keine neuen Algorithmen zur Quantifizierung. Zur Evaluierung und Entwicklung wurde der Workflow an S. pyogenes Cas9 als Standardprotein getestet. Durch das Binden an gRNA vollzieht Cas9 eine drastische Konformationsänderung und sowohl das freie als auch das RNA-gebundene Protein ist röntgenkristallographisch charakterisiert. Diese gut charakterisierte Strukturänderung ist ein ideales Modell um die Änderung der Cross-Link Quantität auf einem biologischen System zu testen. Mit Hilfe der Distanzinformationen, die aus den quantitativen Cross-Linking Experimenten gewonnen wurden, konnten einige Strukturen des Cas9-Riboproteins modelliert werden. Das beste Modell erreichte eine mittlere quadratische Abweichung von <10 Å im Vergleich zur Kristallstruktur. Diese Ergebnisse demonstrieren die potentiellen Anwendungs-möglichkeiten dieser Methode in zukünftigen Forschungsprojekten.
Abstract
(Englisch)
Cross-linking mass spectrometry has become an important extension for the fields of proteomics. In comparison to classical proteomics, not only informations about the presence and quantity of proteins and peptides, but also structural insights into the organization of proteins can be obtained, making cross/linking mass spectrometry also useful for structural biologists. To gain a deeper insight into protein dynamics, there are several attempts to do quantitative XLMS. In this thesis a novel and simple quantitative cross-linking workflow employing isobaric tags for quantitation on the MS2-level is described. In comparison to previously described quantitative methods, it allows multiplexing and does not require any new algorithms for quantitation. For evaluation, the workflow was developed and tested on S. pyogenes Cas9 as model protein. Upon RNA binding, Cas9 undergoes a significant structural rearrangement, where both the free and the RNA bound protein is characterized by x-ray crystallography. This well characterized structural rearrangement represents an ideal biological system to study abundance changes of cross-linked peptides. Using the distance restraints derived from quantitative cross-linking experiments, several structural models of the Cas9-riboprotein were generated. The best model reached a root mean square distance of <10 Å. These results demonstrate the developed approach to produce a meaningful outcome and highlights its potential application in future research projects.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Mass Spectrometry cross-linking Proteomics Protein Chemistry Cas9
Schlagwörter
(Deutsch)
Massenspektrometrie Cross-Linking Proteomics Proteinchemie Cas9
Autor*innen
Christian Stieger
Haupttitel (Englisch)
Development of an isobaric-tag based quantitative cross-linking mass spectrometry method
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung einer auf isobaren Markierungsreagenzien basierenden Cross-Linking Massenspektrometrie-Methode
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
70 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christopher Gerner
Klassifikationen
35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie ,
35 Chemie > 35.62 Aminosäuren, Peptide, Eiweiße
AC Nummer
AC15218144
Utheses ID
45592
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |
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