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Establishing an optogenetic system for spatially and temporally controlled transgene expression in zebrafish
Kristin Fischer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Heinrich Kovar
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13165.70377.226665-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Zur Untersuchung von Signalwegen und Zellantworten während der Entwicklung oder bei Krankheit ist es vorteilhaft über eine präzise räumliche und zeitliche Kontrolle über Genexpression zu verfügen. Optogenetik bietet diese Kontrolle und es sind verschiedene Systeme verfügbar. Hier testete ich zwei optogenetische Systeme, LightOn und CRY2(L348F)-CIB1, bezüglich ihres Potentials Genexpression genau kontrollieren zu können. 
Das LightOn System besteht aus GAVPO, einer Gal4 Variante die durch Bestrahlung mit blauem Licht dimerisiert und aktiviert wird und Gene abwärts von UAS Sequenzen exprimiert. Das CRY2(L348F)-CIB1 System wurde zur Rekonstitution gespaltener Cre Rekombinase unter Einwirkung von blauem Licht verwendet. Ich verwendete transiente Expression durch DNA oder mRNA Injektion dieser Systeme, da diese dann zu späteren Entwicklungsstadien nicht mehr präsent sein würden was einer unabsichtlichen Aktivierung durch Umgebungslicht vorgebeugt. Ich wies nach, dass die Beleuchtung mit blauem Licht und die Expression beider Systeme von Zebrafisch Embryonen gut toleriert wird. Es wurden für beide Systeme Injektionskonzentrationen etabliert, welche bei 2—24 hpi zu effizienter, licht-induzierter Genexpression ohne Hintergrund führt. Mit dem LightOn System lässt sich Genexpression auch noch 24–72 hpi aktivieren. Bei 72—96 hpi war dies nicht mehr möglich wodurch eine Handhabung der Fische bei Umgebungslicht oder Analysen ab diesem Zeitpunkt möglich sind. Dies zeigt, dass transiente Expression optogenetischer Systeme eine realisierbare Strategie zur Aktivierung der Expression von Transgenen bis zu 72 hpf ist. Ich demonstrierte, dass LightOn durch Zwei-Photonen-Absorption aktiviert werden kann und zu Genexpression in Zielzellen führt, weshalb die Anwendung vielversprechend für Fate mapping Studien ist.
Abstract
(Englisch)
Precise spatial and temporal control over gene expression is beneficial for many applications including the investigation of signaling pathways and cell responses in development or disease and fate-mapping studies. Optogenetics provides such control and several systems are available. Here, I tested two blue-light inducible optogenetic systems, LightOn and CRY2(L348F)-CIB1, towards their capability of precisely controlling transgene expression in zebrafish embryos. 
The LightOn system consists of GAVPO, a Gal4 variant, which is activated by blue light induced dimerization to drive expression of transgenes under UAS control. The CRY2(L348F)-CIB1 system was used for blue-light induced reconstitution of a split Cre recombinase. I used transient expression of these optogenetic systems upon DNA or mRNA injection as optogenetic systems would not be present anymore at later developmental stages, thus preventing accidental activation of gene expression by ambient light during fish handling or analysis. I established that blue light illumination and expression of both optogenetic systems are well tolerated in zebrafish embryos. Injection concentrations allowing for efficient light-induced activation of gene expression without background at 2—24 hpi were successfully determined for both systems. The LightOn system was also activatable at 24—72 hpi in zebrafish. At 72—96 hpi this was not possible anymore, suggesting that zebrafish handling under ambient light or analysis is possible. Finally, I demonstrated using two-photon excitation of LightOn at 24 hpi that gene expression can be activated in target cells, indicating that this approach is promising for fate mapping studies.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Optogenetics LightOn Cry2CIB1 Zebrafish Transgene expression
Schlagwörter
(Deutsch)
Optogenetik LightOn Cry2CIB1 Zebrafisch Transgenexpression
Autor*innen
Kristin Fischer
Haupttitel (Englisch)
Establishing an optogenetic system for spatially and temporally controlled transgene expression in zebrafish
Paralleltitel (Deutsch)
Etablierung eines optogenetischen Systems für räumlich und zeitlich kontrollierte Transgenexpression im Zebrafisch
Publikationsjahr
2017
Umfangsangabe
106 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Heinrich Kovar
Klassifikationen
42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC15053168
Utheses ID
46168
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
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