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Selection of an aptamer for fenpropimorph by SELEX
Alice Heylik
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29371.45707.375473-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Fenpropimorph gilt als weit verbreiteter Wirkstoff in Fungiziden, die gegen Pilzbefall von Holz und Nutzpflanzen eingesetzt werden. Aufgrund der gesundheitsschädlichen Nebenwirkungen auf Nicht-Zielorganismen sind Auflagen und Vorschriften zur Anwendung und den Grenzwerten von Rückständen in der Commission Implementing Regulation (EU) No 540/2011 festgehalten. Um die Einhaltung dieser Grenzwerte zu überprüfen, bedarf es genauer und empfindlicher analytischer Nachweismethoden mit niedriger Nachweisgrenze. Abgesehen von den gängigen Analysemethoden wie LC-MS oder GC-MS, wäre ein kostengünstiger, schneller und einfacher Biosensor wünschenswert. Wegen ähnlicher Spezifität und Affinität wie der von Antikörpern und zusätzlichen Vorteilen wie hohe Stabilität, simple Vervielfältigung und die Unabhängigkeit von Tieren für die Produktion, werden Aptamere immer häufiger als selektive Liganden in verschiedenen Anwendungen wie Biosensoren verwendet. Aptamere sind kurze einzelsträngige DNA (ssDNA) oder RNA Moleküle, die durch Änderung ihrer Konformation eine maximale Wechselwirkung mit Zielmolekülen ausbilden können. Aptamere werden durch einen Prozess names SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) gewonnen, bei dem jene Stränge mit der höchsten Affinität für einen Analyten aus einem Pool von etwa 1015 verschiedenen Strängen selektiert werden. Dazu wird dieser Pool mit dem Analyten versetzt, um eine Interaktion zu ermöglichen. Jene Stränge, die keine Affinität zum Analyten aufweisen werden entfernt und jene Stränge mit hoher Affinität zum Analyten mittels PCR vervielfältigt. Die selektierten Stränge jeder Runde dienen als Pool für die nächste Runde, solange bis nur noch jene Stränge mit sehr hoher Affinität zum Analyten übrigbleiben. In dieser Masterarbeit wurde ein SELEX Prozess der bereits ähnlich von Wu et al. 2016; Gao et al. 2016; Gu et al. 2016; Yang et al. 2014; Nguyen et al. 2014 und Park et al. 2011 beschrieben wurde, optimiert. Eine Vorlage einer DNA Bibliothek wurde entworfen und diese Bibliothek als anfänglicher Pool für den SELEX Prozess verwendet. Um jene Stränge, die nur schwache Interaktionen zum Analyten aufweisen von den Aptameren zu trennen wurde Graphenoxid (GO) verwendet, welches die Fähigkeit aufweist, freie ssDNA an seiner Oberfläche zu adsorbieren. Diese immobilisations-freie Methode wird auch GO-SELEX genannt. In einigen Vorversuchen wurden wichtige Schritte, wie die Methode zu Gewinnung von einzelsträngiger DNA nach der PCR und das Lösen von ssDNA nach einer Ethanolpräzipitation optimiert. Zusätzlich wurde das optimale Masseverhältnis von ssDNA zu GO ermittelt. Insgesamt wurden 14 GO-SELEX Runden mit dem Analyten FEN durchgeführt. Um jene Stränge zu entfernen, die hohe Affinität zu Propiconazol, einem Fungizid das häufig in den gleichen Pflanzenschutzmitteln verwendet wird wie FEN, aufweisen, wurden drei “Counter-SELEX“ Runden durchgeführt. Die angereicherten Stränge wurden mittels Next Generation Sequencing sequenziert. Die erhaltenen 4332 Sequenzen wurden anhand ihrer Sequenz in ihrer Haarnadelschleife gruppiert. Aus jeder der drei Gruppen wurde ein Repräsentant (FEN-APT0, FEN-APT2 und FEN-APT7) auserwählt und dessen Affinität zu Fenpropimorph getestet. Wegen der Fähigkeit von Goldnanopartikel (AuNPs), die An- bzw. Abwesenheit von freier ssDNA mittels leicht detektierbaren Farbumschlag anzuzeigen, wurde eine Methode basierend auf AuNPs für diese Masterarbeit ausgewählt. Die Tauglichkeit dieser Methode wurde mittels einem adenosin-spezifischen Aptamer aus der Literatur getestet. Die Ergebnisse der Affinitätstests lassen jedoch darauf schließen, dass die selektierten Aptamerkandidaten keine Affinität zu FEN aufweisen.
Abstract
(Englisch)
Fenpropimorph (FEN) is a widely used active agent in fungicides for wood and food protection against fungal decay. Because of its harmful side effects to non-target organisms, provisions for the application and critical values of residues are preserved in the Commission Implementing Regulation (EU) No 540/2011. To observe these regulations, accurate analytical techniques with low detection limits are needed. Besides conventional analytical methods, e.g. LC-MS or GC-MS, cost effective rapid and simple methods, e.g. biosensors, are required for routine analysis. Aptamers are short ssDNA or RNA strands that can recognize a target molecule, by adapting their three-dimensional structure for maximization of intermolecular interaction. The specificity and affinity of a variety of aptamers have been found to be similar to those of antibodies. Since aptamers show some advantages, including high stability and simple synthesis without the necessity to immunize animals, their application as selective ligands in different methodologies, e.g. biosensors, is increasing. Aptamers are generated by “systematic evolution of ligands by exponential enrichment” called SELEX- process, where the most affine strands for an analyte are selected from a pool of about 1015 different oligonucleotides. Therefore, the pool is incubated with the analyte. After removing non-affine strands, the affine strands are amplified by PCR. These three steps form one SELEX round. The obtained sequences from each round are used as initial pool for the next SELEX round until only the most affine strands are remained. In this work, a SELEX process adapted from Wu et al. 2016; Gao et al. 2016; Gu et al. 2016; Yang et al. 2014; Nguyen et al. 2014 and Park et al. 2011 was optimized. Therefore, an in-house designed ssDNA library was used as initial pool. The ability of graphene oxide (GO) to adsorb free ssDNA on its surface, was used for the separation of non-affine ssDNA and aptamer candidates. This immobilization-free method is called GO-SELEX. In preliminary experiments, important steps were optimized, including generation of ssDNA after PCR amplification and the dissolution of DNA after precipitation with ethanol. In addition, the optimal mass ratio of ssDNA and GO was determined. In total, 14 rounds of GO-SELEX process were performed with the analyte FEN. To remove strands with high affinity to propiconazole, a fungicide, which is often used in the same wood protecting agents as FEN, three rounds of counter-SELEX were performed. The enriched DNA strands were sequenced by next generation sequencing. The FASTA file contained 4,332 sequences, which were sorted and grouped relating to their stem-loop region. Three aptamer candidates, FEN-APT0, FEN-APT2 and FEN-APT7, were tested for their affinity for FEN. Because of the ability of gold nanoparticles (AuNPs) to indicate the presence/absence of free ssDNA by color change, a method based on AuNPs was used in this master thesis. Before AuNPs were used for affinity testing, the suitability of this approach was investigated with an aptamer for adenosine, the sequence of which was taken from literature. Unfortunately, the results obtained in the affinity tests indicate that the selected aptamer candidates do not show any affinity for FEN.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
fenpropimorph aptamer SELEX
Schlagwörter
(Deutsch)
Fenpropimorph Aptamer SELEX
Autor*innen
Alice Heylik
Haupttitel (Englisch)
Selection of an aptamer for fenpropimorph by SELEX
Paralleltitel (Deutsch)
Selektion eines Aptamers für Fenpropimorph mittels SELEX
Publikationsjahr
2018
Umfangsangabe
III, 3, 93 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
Klassifikationen
35 Chemie > 35.39 Analytische Chemie: Sonstiges ,
35 Chemie > 35.65 Nukleinsäuren
AC Nummer
AC15275319
Utheses ID
48360
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1