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Development of ultraplex amplification and detection assays
Rick Conzemius
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (Dissertationsgebiet: Molekulare Biologie)
Betreuer*in
Arndt von Haeseler
Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-10312.34232.886111-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Eine schnelle Identifizierung und Charakterisierung von Krankheitserregern ist essentiell für eine gezielte Therapie da immer mehr Antibiotika an Wirksamkeit verlieren. Gegenwärtige diagnostische Analyseverfahren sind durch die Anzahl gleichzeitig nachweisbarer Pathogene oder durch zeitliche Einschränkungen begrenzt. Die Kultivierung von Mikroorganismen, wie sie für aktuelle Nachweisverfahren erforderlich ist, ist zeitaufwändig und nicht jede bakterielle Spezies ist kultivierbar. Der PCR-Test hat Anwendungen auf dem Gebiet der klinischen Diagnostik zur Identifizierung von Krankheitserregern revolutioniert. Die derzeit verwendeten Systeme sind jedoch für eine breite Nutzung zu teuer, hauptsächlich weil nur wenige Proben gleichzeitig analysiert werden können oder wegen der Abhängigkeit von proprietären Systemen. Diese Probleme können mittels Multiplex-Verfahren gelöst werden, jedoch haben solche Methoden eine verringerte Sensitivität und Spezifität. Wir haben einen Software-Workflow für die vollständige in silico Evaluierung und die thermodynamische Vorhersage spezifischer und unspezifischer Hybridisierungsereignisse von Multiplex-Methoden entwickelt. Wir haben bereits etablierte Multiplex-PCR-Assays optimiert und evaluiert. Dazu haben wir die Mechanismen der Primer-Dimer-Bildung durch Beobachtung der Wechselwirkungen zwischen Primern in Bezug auf Quantität und Qualität mithilfe von NGS, Hochdurchsatz-qPCR und MD-Simulationen untersucht. Wir konnten die Sensitivität nach der Entfernung von unspezifischen Primern verbessern. Danach haben wir den Schwerpunkt auf die Entwicklung neuer Nachweisverfahren gelegt. Zunächst entwickelten wir eine Festphasen-PCR-Methode, die auf einer mit Goldnanopartikel-beschichteten Oberfläche basiert. Diese Methode kombiniert PCR- und Microarray-Technologie in einem Assay. Die neue Technik wurde hinsichtlich Spezifität, Sensitivität, und Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen in klinischen Proben, evaluiert. Zuletzt untersuchten wir Amplifikations- und Marker-unabhängige Nachweissysteme von Bakterien. Wir haben G-Quadruplex-Hybridisierungssonden entwickelt, die bei Hybridisierung eine Peroxidaseaktivität ausüben, die zur Substratumwandlung und folglich farblichen Ablesung verwendet wird. Schließlich haben wir den Weg für die Kombination von Padlock-Sonden mit derselben Ablesung geebnet, die durch G-Quadruplex-DNAzyme katalysiert wird. Wir optimierten die Reaktionsparameter und evaluierten die Spezifität aller Sonden mit synthetischen Fragmenten und klinischen Proben.
Abstract
(Englisch)
Clinicians have an urgent need for improved detection systems for the rapid identification and characterization of pathogens. Since more and more antibiotics are losing their effectiveness, targeted therapy is more important than ever. Current diagnostic assays are limited by the number of simultaneously detectable targets or time constraints due to cultivation-based techniques. As needed for state-of-the-art methods, the cultivation of microorganisms is time-consuming, and not every species is cultivable. The PCR technique has revolutionized practical applications in the field of clinical diagnostics to identify and characterize pathogens. However, the currently employed systems are too expensive for extensive use due to integrations into expensive microfluidic systems, low multiplexing, and a dependence on proprietary systems. Multiplex PCR can solve these issues but has reduced sensitivity and specificity due to a bias towards products with higher amplification efficiency, off-target products, and primer-dimer formation. We developed a software workflow for the in silico evaluation of multiplex assays, including the thermodynamic prediction of specific and unspecific hybridization events. Next, we pre-clinically optimized and evaluated already established multiplex PCR assays. Finally, we elucidated the primer-dimer formation mechanisms by observing interactions between primers in terms of quantity and quality using NGS, high-throughput qPCR, and MD simulations. We demonstrated a higher sensitivity of multiplex PCR after removing primers identified from 45-plex primer sets as generating primer-dimers. After that, we focused on the development of novel methods for gene detection. First, we established a solid-phase PCR method based on a surface coated with GNPs. This method combines PCR and microarray technology in a single assay. We refined the surface and the protocols before evaluating the method for specificity, sensitivity, and the detection of antibiotic resistance genes using clinical isolates. Last, we explored amplification-free and label-free systems for the direct detection of bacteria. We developed G-quadruplex hybridization probes, which upon hybridization, exert a peroxidase activity that converts a substrate for colorimetric readout. Finally, we paved the way for combining padlock probes with the same readout catalyzed by G-quadruplex DNAzymes. We optimized the reaction parameters, evaluated all probes' specificity, and finally, the padlock probes with clinical isolates.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
antibiotic resistance pathogens multiplex PCR solid-phase PCR padlock probes primer-dimers in silico evaluation assay development Molecular Dynamics simulations G-quadruplex DNAzymes
Schlagwörter
(Deutsch)
Antibiotikaresistenz Pathogene Multiplex PCR Festphasen-PCR Padlocksonden Primer-Dimers In silico Evaluierung Assayentwicklung Molekulardynamik-Simulation G-quadruplex DNAzyme
Autor*innen
Rick Conzemius
Haupttitel (Englisch)
Development of ultraplex amplification and detection assays
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung von Ultraplex Amplifikations- und Detektionsmethoden
Publikationsjahr
2020
Umfangsangabe
216 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Bojan Zagrovic ,
Astrid Mach-Aigner
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC16132007
Utheses ID
55912
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1