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Development and implementation of a shRNA screen for inhibitors of the pRB and p53 pathways in mammalian cell cultures
Diego Barcena Menendez
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Sebastian Nijman
DOI
10.25365/thesis.11275
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29741.68972.320361-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Während meiner 12-monatige Diplomarbeit, begab ich mich einen "Loss-of-Function" genetischen Screen zu entwickeln um weitere Inhibitoren der p53-Signalweges zu finden mit der Idee, neue Angriffspunkte für Medikamente für die Krebstherapie zu identifizieren. Meinen Auftrag war ein Selektionssystem zu testen wodurch Zelllzyklus arretierte Zellen gegenüber sich teilende Zellen spezifisch ausgesucht werden sollten. Der Screen besteht in Grunde aus vier spezifische Schritte: Als erstes wird einer p53 Wildtyp, immortalisierte Zelllinie mit einer shRNA Bibliothek bestehend aus 24.000 retrovirale Vektoren gegen 9.000 menschliche Gene infiziert. Die Zellen werden dann im zweiten Schritt einer Be- handlung unterzogen wodurch sich Teilende spezifisch getötet werden. Dies wird erzielt durch Zugabe vom synthetischen nukleosid Bromodeoxyuridin (BrdU), dass während der S-Phase des Zellzyklus von der Polymerase in den Genom statt Thymidin inkorpori- ert wird. Die Zellen werden anschliessend mit der Hoechst #33158 Farbstoff behandelt und nach einer kurze Inkubationszeit mit UVa licht bestrahlt und dadurch werden DNS Doppelstrandbrüche verursacht. Zellen dessen Zellzyklus arretiert wurde durch die Wirkung eines shRNAs werden von der Doppelstrandbrüche verschont, die Selektion dieser Zellen wird im dritten "Auferstehungsschritt" ermöglicht. Nun werden überlebende Zellen mit einem lentiviral exprimierten Large T Antigens infiziert mit der Erwartung die Effekte des shRNAs zu übertrumpfen und die Zellen somit zu stimulieren wieder in Zyklus zu gehen und kolonien bilden. Genomisches DNA wird aus den Kolonien isoliert und der shRNA vektor kann durch PCR identifiziert werden.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
cancer screen
Schlagwörter
(Deutsch)
Krebs Screen
Autor*innen
Diego Barcena Menendez
Haupttitel (Englisch)
Development and implementation of a shRNA screen for inhibitors of the pRB and p53 pathways in mammalian cell cultures
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung und implementierung eines reversen Genetiks RNAi screening Methode um inhibitoren des p53 und pRB Signalwege in menschlichen Zellkulturen zu finden
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
53 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Johann Rotheneder
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC08517289
Utheses ID
10169
Studienkennzahl
UA | 066 | 877 | |