Detailansicht
Differenzierung von Weizensorten basierend auf Proteinmustern mittels Kapillargelelektrophorese-am-Chip
Angela Lehner
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Günter Allmaier
DOI
10.25365/thesis.11582
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29388.06714.398070-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Im Rahmen dieser Diplomarbeit sollte die Übertragbarkeit der SDS-PAGE Methodik von Weizenextrakten zwecks Sortenerkennung und Homogenitätsprüfung auf die CGE-am-Chip Methode untersucht werden.
Trotz der Miniaturisierung der Analysenstrecke sind HMW-GUE mittels CGE-am-Chip elektrophoretisch trenn- und detektierbar. Der Umstieg auf CGE-am-Chip ist jedoch nicht trivial, da sich das Migrationsmuster und die Migrationsreihenfolge der HMW-GUE bei beiden Methoden signifikant unterscheiden.
Die Robustheit der Methode wurde untersucht – die Intra- und Interchipreproduzierbarkeit hat sich bezüglich der Migrationszeit als sehr hoch erwiesen. Die Signalintensität zeigt jedochkeine hohe Reproduzierbarkeit. Weizenextrakte sind auch nach vierwöchiger Lagerung bei 4°C mit Reproduzierbarkeiten im Bereich der Methodenreproduzierbarkeit unproblematisch vermessbar. Auch nach achtwöchiger Lagerung bei 4°C lässt sich für die meisten Proben ein aussagekräftiges CGE-am-Chip-Elektropherogramm erzeugen. Weizenextrakte können bis zu zwei Mal aufgetaut und wieder eingefroren werden, ohne dass sich negative Auswirkung auf die Vermessbarkeit mittels CGE-am-Chip zeigen.
Um trotz der Veränderung des Migrationsmusters zweifelsfreie Zuordnungen der HMW-GUE-Banden zu erlauben, wurde versucht, mittels SDS-PAGE aufgetrennte Weizenproteine aus dem Gel zu extrahieren und erneut durch CGE-am-Chip zu vermessen. Die gewählten Extraktionsmethoden waren Schütteln in 5 unterschiedlichen Extraktionsmittel, Elektroelution und Elektroblott mit anschließender Extraktion von der Membran. Neben zwei unterschiedlichen SDS-PAGE-Gelzusammensetzungen wurde auch eine SDS-PAGE Technik, die teilweise aus einem hydrolytisch spaltbaren Quervernetzter besteht, untersucht inwieweit diese eine Extrahierbarkeit der Weizenproteine zulassen. Mit keiner der gewählten Methoden war es aber möglich, nachweisbare Mengen an HMW-GUE zu extrahieren – als zusätzliche Nachweismethoden wurden MALDI-TOF-MS, SDS-PAGE mit Silberfärbung und ein hochempfindlicher CGE-am-Chip-Assay mit vorangeschalteter Fluoreszenzderivatisierung gewählt. Dies hängt auch mit den speziellen physiko-chemischen Eigenschaften der HMW-GUE Protein zusammen.
Zusätzlich wurde die Möglichkeit der CGE-am-Chip-Banden(Peak)zuordnung mittels statistischer Methoden untersucht. Zwei unüberwachte statistische Methoden (Hierarchische Clusteranalyse und PCA) und eine überwachte Methode (visuelle Zuordnung) wurden angewendet. Der zur Verfügung stehenden Datensatz (38 unterschiedliche Proben, 15 verschiedene Weizensorten, 9 unterschiedliche HMW-GUE-Sätze) war zu uneinheitlich, um mittels unüberwachten statistischen Methodeneine eindeutige Zuordnung treffen können. Durch Vermessen größerer bzw. einheitlicherer Datensätze könnte in Zukunft jedoch auch mittels dieser Strategie und den aufgezeigten Methoden eine Zuordnung gelingen. Mit der überwachten statistischen Methode ist die Zuordnung jedoch gelungen. Aus der visuellen Zuordnung ergeben sich einige überraschende Erkenntnisse für die CGE-am-Chip von Weizenextrakten. So liefern manche Allele nicht zwei, sondern drei Signale. Eine Aufspaltung der als 2* bezeichnete SDS-PAGE-Bande in zwei Untergruppen mit sehr unterschiedlichen Migrationszeiten wurde für zwei verschiedene Weizensorten beobachtet (jeweils nur eine der Varianten kommt bei einer Sorte vor). Für die Weizensorte Alora konnte ein zusätzliches Signal im CGE-am-Chip-Elektropherogramm beobachtet werden, das bisher noch nicht beschrieben war.
Abstract
(Englisch)
The aim of this master thesis was to investigate whether the SDS-PAGE method for wheat grain extracts for variety and homogeneity control is transferable to the highthroughput CGE-on-a-chip method.
Despite the miniaturization of the separating segment, HMW-GUE can be separated and detected in the lab-on-a-chip system. Due to changing migration patterns and migration sequences of the HMW-GUE, however, a change of method is nontrivial.
The validity of the method was tested – the intra- and inter-chip reproducibility of the migration time is rather high, the signal intensity is however not very reproducible. After storage at 4°C for four weeks wheat extracts can still be measured with good reproducibility close to the method’s technical reproducibility. Even after storage at 4°C for eight weeks conclusive CGE-on-a-chip electropherograms could be obtained. Extracts of wheat can undergo up to two thaw-freeze cycles without causing degrading results obtained by means of the CGE-on-a-chip technique.
In order to assign protein bands despite the changed migration sequence it was tried to extract wheat proteins which had been separated via SDS-PAGE from those gels and measure them on the chip. The chosen methods of extraction were shaking with five different eluants, electroelution and electroblotting with subsequent elution from the membrane. In addition to two different compositons of SDS-PAGE-gels, a SDS-PAGE-gel with partly hydrolytically cleavable crosslinker was investigated in terms of its extractability of wheat proteins. None of these methods allowed extracting detectable amounts of HMW-GUE. Additional methods of detection were MALDI-TOF-MS, SDS-PAGE with silver staining and a high sensitivity CGE-on-a-chip assay with direct fluorescence dye labeling. The difficulties are closely associated with the special physic-chemical quality of the HMW-GUE proteins.
The possibilities of protein band assignment by means of statistical methods were examined, too. Two unsupervised statistical methods (hierarchical cluster analysis and PCA) and one supervised method (visual assignment) were evaluated. The available data set (38 different samples, 15 different wheat varieties, 9 different HMW-GUE-sets) were too heterogeneous in order to obtain a clear assignment through unsupervised statistical methods. Larger and more homogeneous data sets could however allow a wheat assignment through unsupervised statistical methods in the future.On the other hand an assignment was obtained successfully through a supervised statistical method (visual assignment).
Based on this method some surprising results could be obtained for certain wheat protein bands. Some alleles showed not two, but three signals. Splitting of the SDS-PAGE band called 2* to two signals with very different migration times could be observed for two different wheat varieties (for each wheat variety, respectively, only one 2* signal). An additional signal could be observed for the CGE-on-a-chip electropherogram of the wheat variety Alora which has not been described so far.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
wheat vareity variety differentiation CGE CGE-on-a-chip capillary gel electrophoresis-on-a-chip capillary gel electrophoresis miniturisation protein protein pattern micro fluidics Glutenin Glutenin subunits
Schlagwörter
(Deutsch)
Weizen Sortenerkennung Kapillargelelektrophorese Kapillargelelektrophorese-am-Chip CGE CGE-am-Chip Miniturisierung Protein Proteinmustererkennung Proteinmuster Mikrofluidik Gluteninuntereinheiten
Autor*innen
Angela Lehner
Haupttitel (Deutsch)
Differenzierung von Weizensorten basierend auf Proteinmustern mittels Kapillargelelektrophorese-am-Chip
Paralleltitel (Englisch)
Differentiation of wheat varieties based on patterns of proteins using capillary gel electrophoresis-on-a-chip
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
123 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Günter Allmaier
AC Nummer
AC08456500
Utheses ID
10452
Studienkennzahl
UA | 419 | | |