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Molecular and phytochemical analyses of the genus Origanum L. (Lamiaceae)

Brigitte Lukas

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Rosabelle Samuel

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DOI

10.25365/thesis.11737

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29352.37875.440263-5

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Gattung Origanum (Lamiaceae) umfaßt 43 Arten. Majoran (O. majorana) und Oregano (verschiedenen Origanum Arten) werden als Arznei- und Gewürzpflanzen genutzt. Die antimikrobielle und antioxidative Aktivität einiger Origanum Arten eröffnet auch eine Reihe von neuen Anwendungsfeldern in der Pharma-, Kosmetik- sowie Lebens- und Futtermittelindustrie. Origanum ist eine schwierige Gattung und nahezu alle seiner 9 Sektionen sind mit taxonomischen Unsicherheiten behaftet. Um das bestehende Gattungskonzept auf seine Anwendbarkeit zu prüfen wurden anhand von DNA-Sequenzinformation (ITS – Internal transcribes spacers; DXS – 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase; psbA-trnH) die Verwandschaftsverhältnisse in der Gattung analysiert. Spezielle Aufmerksamkeit wurde hierbei Sektion Majorana gewidmet deren Mitglieder (O. majorana, O. syriacum, O. onites und O. dubium) zu den am stärksten genutzten Origanum Arten zählen (Lukas et al., in Vorbereitung). Die erarbeiteten Daten weisen O. onites und O. syriacum als alte Arten der Sektion Majorana aus. Origanum dubium ist eine Hybridart die Merkmale von O. onites, O. syriacum und einer dritten, unbekannten Art aufweist, O. majorana stammt direkt von O. syriacum ab. Die Analyse von fünf Mikrosatelliten-Loci zeigte, daß O. onites und O. dubium in ihrem Überschneidungsgebiet in der Türkei rezent miteinander hybridisieren. Die verwendeten SSR-Marker wurden anhand von „expressed sequence tags“ (ESTs) von O. vulgare entwickelt (Novak et al., 2007). Insgesamt dreizehn EST-SSR Loci wurden evaluiert. Alle der dreizehn Loci konnten auch in in der entfernt verwandten Art O. majorana amplifiziert werden und scheinen somit für evolutionäre Studien in der Gattung und eventuell auch in nah verwandten Gattungen wie Thymus oder Satureja geeignet. Für die Analyse der Mikrosatelliten wurde eine neue Methode entwickelt die auf High-resolution melting curve analyses (HRM) basiert (Mader et al., 2008). Bei der HRM wird im Anschluß and die PCR die Floureszenz eines interkalierenden Farbstoffes gemessen, der entsprechend eines Temperaturgradienten während der Dissoziation der doppelsträngigen DNA frei wird. Die Form der resultierenden Schmelzkurve ist spezifisch für das PCR-Produkt und hängt von GC-Gehalt, Länge und Sequenzkomposition des Amplikons ab. Zur Analyse von Mikrosatelliten werden die Schmelzkurven vergleichend analysiert und gruppiert. Zur korrekten Zuordnung von heterozygoten Proben werden die entsprechenden Schmelzkurven mit jenen von künstlichen DNA Mischungen homozygoter Proben verglichen. Die Methode hat sich als schnell, kostengünstig und sensitiver als herkömmliche Analyse-Methoden erwiesen. Im Zuge einer Untersuchung über die PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors) Aktivierung durch Oregano oder Oregano-Komponenten wurden DNA-Seqenzanalysen (ITS und DXS) durchgeführt um den botanischen Ursprung des für die Studie verwendeten Pflanzenmaterials zu bestimmen (Müller et al., 2008). Im Falle handelsüblicher Oregano-Proben erlaubte die DNA-Analyse eine eindeutige Identifizierung des Pflanzenmaterials. Die Analyse von Oregano-Trockenextrakten erwies sich aufgrund der geringen Mengen an extrahierbarer DNA hingegen als schwierig. Bei der Arbeit mit DNA aus Trockenextrakten war eine Amplifikation von DXS nicht möglich, eine Amplifikation von ITS gelang lediglich bei einem Teil dieser Proben. Verschiedene Gruppen von Pflanzeninhaltsstoffen sind für den Gebrauch von Origanum Arten als Arznei- und Gewürzpflanzen verantwortlich. Zu den wichtigsten zählen hier die Mono- und Sesquiterpene (Bestandteile des ätherischen Öls) die für das Aroma und die antimikrobielle Aktivität verantwortlich sind. Um bestehende Wissenslücken über die intra- und interspezifische Variabilität dieser Inhaltsstoffe zu schließen, wurden Populationen ausgewählter Origanum Arten hinsichtlich dieser Inhaltsstoffe untersucht. In Populationen von korsischem O. vulgare waren drei verschiedene Chemotypen präsent: ein ‚cymyl’-Chemotyp mit Carvacrol oder Thymol als Hauptkomponente, ein ‚sabinyl’-Chemotyp mit hohem Gehalt an Sabinen und cis-Sabinenhydrat sowie ein ‚gemischter’Chemotyp (Lukas et al., 2008). Das Ätherische Öl von syrischem O. syriacum wurde von Thymol und/oder Carvacrol dominiert und enthielt außerdem hohe Mengen an Thymoquinon, einer für die Krebstherapie vielversprechende Substanz (Lukas et al., 2009). In Populationen von zypriotischem O. majorana wurden drei verschiedene Chemotypen detektiert: ein reiner sabinyl’-Chemotyp (mit typischem Majoran-Aroma), ein reiner alpha-terpineol-Chemotyp sowie ein ‚gemischter’ Chemotyp (Novak et al., 2008). Arbutin ist ein Inhaltsstoff der wegen seiner hohen biologischer Aktivität in Lebensmitteln unerwünscht ist. Eine umfassende Analyse ergab, daß O. dubium und O. majorana hohe Mengen an Arbutin anreichern und daß auch kommerziell gehandelter Majoran und Oregano hohe Arbutinmengen aufweisen. O. microphyllum, O. onites, O. saccatum, O. solymicum, O. husnucan-baseri, O. syriacum und O. vulgare enthalten nur geringe Mengen bzw. kein Arbutin (Lukas et al., 2010). Es wurde außerdem gezeigt, daß nur ein Gen für den Arbutin-Polymorphismus in Origanum verantwortlich ist. Durch gezielte Züchtungsarbeit wäre somit die Produktion von arbutinfreiem Majoran und Oregano möglich. Zur Analyse von Arbutin in Majoran und Beerenträubel-Blättern wurde eine neue, schnelle und selektive GC-Methode etabliert (Lamien-Meda et al., 2009). In der Gattung Origanum variiert die Komposition des Ätherischen Öls sowohl zwischen als auch innerhalb einzelner Arten. Um mehr über die genetischen Grundlagen der Chemotypen zu erfahren wurde ein Teil des γ-Terpinen Synthase Gens, ein Schlüssel-Gen für die Biosynthese der ‚cymyl’-Komponenten, sequenziert (Lukas et al., akzepiert). Sechs verschiedene Varianten des Gens wurden identifiziert wobei die Synthese der ‚cymyl’-Komponenten an das Vorhandensein bestimmter Genvarianten gebunden war. Die Komposition des Ätherischen Öls wird aber auch von Umweltfaktoren beeinflusst. Um den Einfluß der Temperatur zu untersuchen wurden Klone von O. vulgare x O. majorana (enthält ‘cymyl’- und ‘sabinyl’-Komponenten) und O. syriacum ssp. syriacum (enthält nur ‘cymyl’-Komponenten) unter unterschiedlichen Temperaturbedingungen kultiviert (Novak et al., akzeptiert). Die Biosynthese der wichtigsten ‚sabinyl’-Komponenten wurde durch die Temperatur nicht beeinflusst. Die Biosynthese der wichtigsten ‚cymyl’-Komponenten zeigte sich jedoch von der Temperatur beeinflusst.

Abstract

(Englisch)

The genus Origanum (Lamiaceae) comprises 43 species and 18 hybrids. Majoram (O. majorana) and oregano (several Origanum species) have worldwide been used as kitchen herbs and folk remedies. The high antimicrobial and antioxidant activity of some Origanum species opens a wide range of further application possibilities of Origanum plant material in food-, feed-, pharmaceutical- and cosmetics-industry. The taxonomy of the genus Origanum is complex and nearly all of the nine sections are afflicted with taxonomic uncertainties. DNA sequence information of the two nuclear gene regions ITS (Internal transcribed spacers) and DXS (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) as well as of the chloroplast psbA-trnH intergenic spacer was used to test the currently accepted genus concept for its applicability. The investigation focused on the evolutionary relationships of the four essential oil rich taxa of section Majorana (O. majorana, O. onites, O. syriacum and O. dubium), which are amongst the most widely used Origanum species (Lukas et al., in preparation). The combined DNA data revealed O. onites and O. syriacum as ancient species in the section. Origanum dubium was found to be of hybridogeneous origin combining attributes of O. onites, O. syriacum and a third Origanum species that remained unknown. The results show that O. majorana directly derived from O. syriacum. Sequence analysis as well as the analysis of five microsatellite loci provided evidence for recent hybridisation between Turkish O. onites and O. dubium. The SSR markers used were developed from expressed sequence tags (ESTs) of essential oil glands of O. vulgare (Novak et al., 2007). In total, thirteen EST-SSR loci were evaluated using one population of O. vulgare and one of O. majorana. All primer developed for O. vulgare cross-amplified in the distantly related O. majorana and may therefore be useful for evolutionary analyses of the genus and of closely related Lamiaceae like Thymus or Satureja. To analyse microsatellites a novel strategy was introduced (Mader et al., 2008). HRM (high resolution melting curve analyses) is a technique that measures the decreasing fluorescence of an intercalating dye in the process of dissociation of double stranded DNA. The shape of the resulting melting curve depends on GC content, length and sequence composition of the amplicon. HRM can be used for microsatellite analysis but also for other codominant marker systems by implementing a protocol of comparative melting curve assignment. To aid the correct assignment of heterozygous samples artificial mixtures of homozygous samples have to be included. The method was shown to be fast, cheap and more sensitive than standard protocols for microsatellite analysis. In the course of an investigation dealing with PPAR (peroxisome proliferator-activated receptors) activation by oregano sequence analysis of ITS and DXS was performed to identify the botanical origin of the plant material investigated (Müller et al., 2008). In case of commercial plant material sequence analysis was useful to complement evidence from morphological characteristics. The two different DNA markers used allowed an unambigous determination of the respective plant material. In case of dried plant extracts sequence analysis was complicated by the tiny amounts of extractable DNA. When dealing with such traces of DNA the amplification of DXS was not possible and the amplification of ITS was successful for some of the dried extract samples only. Different groups of active compounds are responsible for the use of Origanum species as medicinal and aromatic plants. The most important are the mono- and sesquiterpenes, responsible for flavour and antimicrobial activity. Selected Origanum species were analysed for presence and quantity of these active compounds. In populations of Corsican O. vulgare three different chemotypes were present: a ‘cymyl’-type with either carvacrol or thymol as main compound, a ‘sabinyl’-type with large amounts of sabinene and cis-sabinene hydrate and a ‘mixed’ chemotype combining compounds of the ‘cymyl’- and the ‘sabinyl’-pathway (Lukas et al., 2008). In populations of Syrian O. syriacum the essential oil was dominated by carvacrol and/or thymol (Lukas et al., 2009). In Syrian O. syriacum thymoquinone, a promising substance for cancer therapy, was present in a wide range. Selected accessions of O. syriacum could be the basis for an oregano cultivar rich in thymoquinone. In populations of Cypriot O. majorana three different chemotypes were detected (Novak et al., 2008). Besides the standard ’marjoram’ composition (a pure ‘sabinyl’-chemotype), a pure alpha-terpineol chemotype and a mixed sabinyl/alpha-terpineol chemotype were also present. Arbutin, a hydroquinone derivate, is a substance non desired in the human diet. Within the genus Origanum the formation of arbutin is polymorphic, with arbutin present in considerable amounts (O. majorana and O. dubium), minor amounts (O. microphyllum, O. onites, O. saccatum, O. solymicum) or completely absent (O. husnucan-baseri, O. syriacum, O. vulgare) (Lukas et al., 2010). Whereas the most important commercial oregano species (O. onites and O. vulgare) contain no or only minor amounts of arbutin, marjoram (O. majorana) has considerably high amounts. From the results of an inheritance study it was concluded that only one gene is responsible for the arbutin polymorphism in Origanum. The absence of arbutin in O. vulgare and O. syriacum would enable the breeding of arbutin-free marjoram. For the analysis of arbutin in marjoram and bearberry a rapid and selective GC method was established (Lamien-Meda et al., 2009). Polymorphic essential oil variation can be observed among and within Origanum species. To learn more about the formation of essential oil chemotypes sequence analyses of the γ-terpinene synthase gene, a key enzyme in the biosynthesis of ‘cymyl’-compounds, were performed (Lukas et al., accepted). The analyses revealed six different variants of the gene. The formation of ‘cymyl’-compounds was associated with the presence of certain variants in a plant. In plants lacking these variants ‘cymyl’-compounds were absent or present in traces only. The composition of secondary metabolites is also modified by environmental conditions. To study the influence of temperature clones of O. vulgare x O. majorana (containing ‘cymyl’- and ‘sabinyl’-compounds) and O. syriacum ssp. syriacum (containing ‘cymyl’-compounds only) were cultivated at different temperature levels (Novak et al., accepted). The biosynthesis of the major ‘sabinyl’-compound was not effected by temperature while the biosynthesis of the major ‘cymyl’-compounds was significantly influenced.

Autor*innen

Brigitte Lukas

Haupttitel (Englisch)

Molecular and phytochemical analyses of the genus Origanum L. (Lamiaceae)

Paralleltitel (Deutsch)

Molekulare und phytochemische Analysen der Gattung Origanum L. (Lamiaceae)

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

179 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Cristina Figueiredi ,

Christian Zidorn

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

42 Biologie > 42.59 Botanik: Sonstiges

AC Nummer

AC08320825

Utheses ID

10591

Studienkennzahl

UA | 091 | 438 | |

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