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Chloroplast-localized protein kinases and a peek at the impact of protein acylation on chloroplast import

Roman Bayer

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Markus Teige

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29101.44666.951270-7

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Chloroplasten sind jene Organellen, die durch CO2-Fixierung die photoautotrophe Lebensweise von Pflanzen ermöglichen. Außerdem verrichten sie viele wichtige Prozesse wie zum Beispiel die Biosynthese von Aminosäuren, Vitaminen oder Hormonen. Zur Regulierung dieser Prozesse ist der Chloroplast in das zelluläre Netzwerk der Signaltransduktion integriert, in dem Proteinkinasen eine zentrale Rolle spielen. Basierend auf Lokalisierungsvorhersagen werden im Chloroplasten zumindest 70 Proteinkinasen erwartet, bisher wurden jedoch nur wenige beschrieben, wie zum Beispiel die „state transition“ Kinasen STN7 und STN8, oder die Plastid-Transkriptionskinase CKII. Diese Dissertation hatte die Identifizierung neuer chloroplastenlokalisierter Proteinkinasen in höheren Pflanzen als Ziel. Dazu wurde ein Kandidaten-, ein phylogenetischer und ein proteomischer Ansatz angewandt. Im Zuge des Kandidatenansatzes wurden Proteinkinasen aufgrund von Chloroplastenvorhersage ausgewählt und deren Lokalisierung mittels YFP (yellow fluorescent protein)-Fusionsanalyse untersucht. Der phylogenetische Ansatz basierte auf der Hypothese, dass vom cyanobakteriellen Plastidenvorfahren abstammende Proteinkinasen eventuell im Chloroplasten beibehalten wurden. Daher wurden die zwischen Arabidopsis thaliana und Cyanobakterien evolutionär konservierten Proteine bestimmt und die Lokalisierung der dabei entdeckten Proteinkinasen mittels YFP-Fusionsanalyse untersucht. Im proteomischen Ansatz wurde Proteinkinasen, die aus Proteinextrakten von isolierten Chloroplasten durch verschiede chromatographische Methoden angereichert wurden, mittels Massenspekrometrie identifiziert und anschließend YFP-Lokalisierungsstudien unterzogen. Von allen neu identifizierten Proteinkinasen konnte nur die Chloroplastenlokalisierung einer einzigen ungewöhnlichen Proteinkinase bestätigt werden. Trotzdem führte der proteomische Ansatz zur Identifzierung neuer Chloroplastenproteine, und ein Vergleich der affinitätsaufgereinigten stromalen Proteome von Pisum sativum und Arabidopsis offenbarte unerwartete entwicklunszustands- und/oder artspezifische Unterschiede. Zu guter Letzt wurde die Regulierung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen durch co- und posttranslationale N-terminale Acylierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die calciumabhängige Proteinkinase CDPK16 aus Arabidopsis durch N-terminale Myristoylierung und Palmitoylierung in der Plasmamembran verankert ist. Bei Entfernung der Myristoylierung wurde CDPK16 jedoch in den Chloroplasten eingeschleust. Umgekehrt konnte der Chloroplastenimport der Arabidopsis-Proteine FNR und Rubisco-Aktivase, die normalerweise keine N-terminalen Lipidmodifizierungen aufweisen, durch künstliche Einführung von Myristoylierung und Palmitoylierung verhindert werden.

Abstract

(Englisch)

Chloroplasts are the fundamental organelles enabling the photoautotrophic life style of plants. Besides their outstanding physiological role in fixating atmospheric CO2, chloroplasts harbor many important processes such as the biosynthesis of amino acids, vitamins or hormones. It is crucial that these processes are tightly regulated and coordinated in response to environmental changes. Thus, the chloroplast is integrated into the cellular network of signal transduction with protein kinases as the key mediators. Based on targeting prediction at least 70 protein kinases are expected to be present inside the chloroplast. However, so far only very few chloroplast protein kinases have been reported in the literature including the “state transition” kinases STN7 and STN8 and the plastid transcription kinase CKII. This thesis aimed at the identification of novel chloroplast-localized protein kinases in higher plants. To this end, three different strategies were developed: a candidate, a phylogenetic and a proteomic approach. In the course of the candidate approach protein kinases were selected based on chloroplast targeting prediction and their subcellular localization was investigated by YFP (yellow fluorescent protein)-fusion analysis. The phylogenetic approach was based on the hypothesis that protein kinases derived from the cyanobacterial plastid ancestor could have been maintained in the chloroplast. Hence, evolutionary conserved proteins between Arabidopsis thaliana and cyanobacteria were determined and the localization of identified protein kinases was examined by YFP-fusion analysis. The proteomic approach aimed at the mass spectrometric identification of protein kinases enriched from extracts of isolated chloroplasts by various chromatographic techniques. Detected protein kinases were subjected to verification by YFP localization studies. Taken together, of all novel protein kinases identified, only one unusual protein kinase could be confirmed to be chloroplast-localized. Nevertheless, the proteomic approach led to the identification of novel chloroplast proteins with important metabolic or regulatory functions. And furthermore, a comparison of affinity-purified stromal proteomes of Pisum sativum and Arabidopsis revealed unexpected developmental state- and/or species-specific differences. Last but not least, the regulation of the subcellular localization of proteins by co- and posttranslational N-terminal acylation was analyzed. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase CDPK16 was shown to be plasma membrane attached via N-terminal myristoylation and palmitoylation, but upon removal of the myristic acid moiety the protein was relocated to chloroplasts. Vice versa, the chloroplast import of the known Arabidopsis chloroplast proteins FNR and Rubisco activase, which lack N-terminal lipid modifications, could be inhibited by artificial introduction of myristoylation and palmitoylation.

Autor*innen

Roman Bayer

Haupttitel (Englisch)

Chloroplast-localized protein kinases and a peek at the impact of protein acylation on chloroplast import

Paralleltitel (Deutsch)

Chloroplastenlokalisierte Proteinkinasen und ein kurzer Blick auf den Einfluss von Proteinacylierung auf den Chloroplastenimport

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

116 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Enrico Schleiff ,

Wolfgang Löffelhardt

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08448263

Utheses ID

10696

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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