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The potential role of ribosome heterogeneity in regulation of protein synthesis in Escherichia coli
Anna Chao Kaberdina
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Isabella Moll
DOI
10.25365/thesis.11924
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30262.56905.472253-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Ausbildung des ternären Translationsinitiationskomplexes, bestehend aus
der 30S Untereinheit des Ribosomes, der fMet-tRNA-fMet und der mRNA, ist der
limitierende Schritt in der Proteinbiosynthese in Bakterien. Die Bildung des
Initiationskomplexes kann durch verschiedene Merkmale der 5´-untranslatierten Region
der mRNA moduliert werden. Diese Merkmale fehlen den sogenannten
„leaderless“ mRNAs, die in Bakterien, Archaea und Eukaryoten vorhanden sind. Da
diese mRNAs direkt mit dem 5´-terminalen Startkodon beginnen, weisen sie keine
spezifischen Translationsinitiationssignale außer dem AUG Startkodon auf.
Vorangegangene Studien in unserem Labor haben gezeigt, dass die Initiation an
„leaderless“ mRNAs über einen alternativen Initiationsweg -über nicht-dissoziierte 70S
Ribosomen- ablaufen kann.
In der vorliegenden Studie wurde die Translation von „leaderless“ mRNAs in
Gegenwart des Antibiotikums Kasugamycin näher untersucht. Dieses Aminoglycosid
hemmt die Initiation der Translation an kanonischen mRNAs. Im Gegensatz dazu,
werden „leaderless“ mRNAs auch in Gegewart des Antibiotikums translatiert. Wir
konnten zeigen, dass in Gegenwart des Antibiotikums protein-defiziente Ribosomen
gebildet werden, denen mehr als sechs Proteine, darunter die essentiellen Proteine S1
und S21, fehlen. Diese ribosomalen 61S Partikel sind für die selektive Translationder
„leaderless“ mRNA in Gegenwart von Kasugamycin verantwortlich. Weiters konnte ich
durch Strukturanalysen das Fehlen der ribosomalen Proteine auf eine, durch die
Bindung von Kasugamycin an 70S Ribosomen induzierte Konformationsänderung der
16S rRNA der 30S Untereinheit zurückführen. Zusammengefasst geben diese
Ergebnisse einen ersten Hinweis auf die Funktionalität von protein-defizienten
Ribosomen in vivo und eröffnen somit auch einen möglichen Einblick in die evolutionäre
Entwicklung des Proteinbiosyntheseapparats.
Eine Funktion des Initiationsfaktor 2 ist die Stimulation der Assoziation der
ribosomalen Untereinheiten. Eine erhöhte Konzentration des Faktors in der Zelle führt
dadurch vermehrt zur Bildung von 70S Ribosomen in der Zelle. Dadurch könnte IF2
auch die Bildung von 61S Partikeln stimulieren. Zusätzlich kommt es durch die IF2-
abhängige GTP-Hydrolyse zu einer Konformationsänderung in der 30S Untereinheit, die
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einen zusätzlichen Effekt auf den Verlust der ribosomalen Proteine haben könnte. In der
vorliegenden Arbeit konnte ich diese hypothetische Funktion von IF2 durch in vivo
Studien bestätigen. Interessanterweise haben meine Ergebnisse zusätzlich gezeigt,
dass es nach Inkubation mit Kasugamycin zur Akkumulierung von kürzeren IF2
Polypeptiden kommt. Nähere Untersuchungen dieses Phänomens wiesen darauf hin,
dass die Ausbildung dieser kuzen Polypeptide nicht auf Proteolyse, sondern auf die
selektive Translation von verkürzten, „leaderless“ mRNAs zurückgefuhrt werden kann.
Diese 5´-terminale Prozessierung der mRNA, die zur Entfernung eines Teiles der
kodierenden Sequenz führt, ist abhängig von der Endoribonuclease MazF. MazF ist Teil
eines Toxin-Antitoxin-Systems in Escherichia coli, das durch verschiedene
Stressbedingungen, wie z.B. auch Inkubation mit einem Antibiotikum, induziert wird. Wir
konnten zeigen, dass die MazF-Aktivität, die zur Degradierung der Mehrzahl der mRNAs
führt, auch zur Ausbildung bestimmter „leaderless“ mRNAs führt. Im Fall von infB
konnten wir auch die Bildung von verkürzten mRNAs nachweisen, deren Translation zur
Synthese von N-terminal verkürzten IF2 Polypeptiden führt. Zusammengefasst, weisen
diese Ergebnisse auf einen möglichen Stressanpassungs-mechanismus hin, der die
Proteinsynthese unter Stressbedingungen durch die Ausbildung von
„leaderless“ mRNAs, die durch protein-defiziente Ribosomen translatiert werden können,
modifiziert.
Im letzten Teil dieser Arbeit habe ich die Bindung des ribosomalen Proteins S1
an die 30S Untereinheit näher untersucht. S1 bindet durch Protein-Protein-Interaktionen
an das Ribosom. Da diese Interaktion nur für Gram-negative Bakterien essentiellen ist,
könnte ein Molekül, das diese Bindung verhindert, eine selektive antimikrobielle Wirkung
auf Gram-negative Bakterien haben. Vorrangegangene Studien in unserem Labor
wiesen darauf hin, dass das ribosomale Protein S2 für die Bindung von S1 an das
Ribosom notwendig ist. Daher war ein Ziel dieser Arbeit die nähere Charakterisierung
der Interaktion zwischen den Proteinen S1-S2. Mit Hilfe einer NMR-basierten Methode
konnte ich die direkte Protein-Protein-Interaktion nachweisen. Weiters haben Studien mit
verkürzten Protein S1 Varianten gezeigt, dass die N-terminale Domäne für diese
Bindung verantwortlich ist, und dass Überexpression dieser Dömäne das Wachstum von
Escherichia coli hemmt, indem es die Bindung des nativen Proteins S1 an das Ribosom
hemmt. Zusammengefasst, unterstützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass die
S1/S2 Interaktion ein potentielles Angriffsziel für die Entwicklung neuer semi-selektiver
antimikrobieller Wirkstoffe darstellt.
Abstract
(Englisch)
The rate limiting step in prokaryotic translation is the formation of the ternary
translation initiation complex, comprising the 30S ribosomal subunit, the fMet-tRNAf
Met,
and mRNA. The efficiency of the translation initiation complex formation is modulated by
the intrinsic features of the 5’-untranslated region (UTR). In contrast, leaderless mRNAs,
which are translated in all three kingdom of life, lack ribosomal recruitment signals other
than the 5’-terminal AUG-start codon. Previous studies in our laboratory have shown that
leaderless mRNAs employ an alternative pathway for translation initiation, which
involves 70S monosomes.
In this study I focused on the phenomenon of sustained translation of leaderless
mRNAs in the presence of the antibiotic Kasugamycin (Ksg). I found that Ksg treatment
induced the formation of stable 61S particles in vivo. Furthermore, my data
demonstrated, that although the 61S particles were devoid of more than six proteins of
the small subunit, including the functionally important proteins S1 and S12, they were
still proficient in translation of leaderless mRNAs. Moreover, structural analysis of the
16S rRNA determined by primer extension analyses revealed that the lack of these
ribosomal proteins in the small subunit could be attributed to structural changes induced
by Ksg binding. These results provide in vivo evidence for the functionality of ribosomes
devoid of multiple proteins and shed light on the evolutionary history of ribosomes.
The experiments performed in our laboratory revealed that after prolonged
treatment with Ksg (up to 120 min) translation of about 5% of E. coli proteins was
resumed compared to their blocked synthesis during the first 60 minutes of Ksg
treatment. Therefore, in the second part of this study, we further studied this
phenomenon and the data obtained revealed that a number of E. coli mRNAs became
leaderless upon antibiotic treatment, which resulted in their selective translation in the
presence of Ksg. Moreover, further analysis suggested that the appearance of
conditional leaderless mRNAs upon Ksg treatment likely involved the E. coli RNA
interferase MazF, the toxin component of the MazEF toxin-antitoxin system.
The formation of 70S monosomes via association of the 30S and 50S ribosomal
subunits has been shown to be assisted by the initiation factor 2 (IF2). This suggests
that IF2 can potentially stimulate formation of 61S particles by increasing the pool of 70S
ribosomes, which are subsequently converted to 61S particles in the presence of Ksg.
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Moreover, the GTP hydrolysis on IF2 induces structural rearrangements in the 30S
subunit, which might result or induce the loss of the respective ribosomal proteins to
form 61S particles. Therefore, in the third part of this study I investigated whether IF2 is
also able to facilitate formation of 61S ribosomal particles during Ksg treatment. Our in
vivo experiments were able to confirm this hypothesis. Moreover, our data revealed that
Ksg treatment additionally leads to accumulation of truncated IF2 polypeptides. Further
analysis indicated that formation of the truncated IF2 polypeptides could be attributed to
translation of leaderless infB mRNA variants lacking 5’-coding regions of this transcript.
Primer extension analysis showed that accumulation of leaderless infB mRNA variants
occur in the wild-type E. coli strain treated with Ksg and is stimulated by MazF
overexpression but does not occur in a mazF mutant lacking the functional RNA
endoribonuclese (interferase) MazF. Therefore, our data suggest that truncated forms of
the infB transcript are likely generated by means of infB mRNA processing by MazF
during Ksg treatment. Taken together, these observations suggest a novel adaptation
mechanism leading to formation of leaderless mRNAs selectively translated by modified
ribosomes accumulating upon stress.
S1 is essential for translation in Gram-negative bacteria. It binds to the 30S
ribosomal subunit through protein-protein interaction. Biochemical evidence showed the
requirement of protein S2 for assembly of S1 to the ribosome. Therefore, in the fourth
part of my study, I scrutinized the S1-S2 protein-protein interactions which might serve
as a potential target for novel antimicrobial compounds acting selectively against Gramnegative
pathogens. I used an NMR-based approach to study the interaction between
protein S1 and S2. The results indicate that S1 and S2 can directly interact with each
other. Furthermore, the truncated variants of S1, S1106 and S1194, bind to the ribosome in
the same manner as the full-length S1 protein. Moreover, we show that overproduction
of S1106 inhibits bacterial growth. This effect could be attributed to the ability of this
polypeptide to substitute endogenous S1, thus yielding translationally inactive ribosomes.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
ribosome heterogeneity translation regulation Escherichia coli
Schlagwörter
(Deutsch)
Heterogene Ribosomen Regulatoren der Translation Escherichia coli
Autor*innen
Anna Chao Kaberdina
Haupttitel (Englisch)
The potential role of ribosome heterogeneity in regulation of protein synthesis in Escherichia coli
Paralleltitel (Deutsch)
Heterogene Ribosomen als mögliche Regulatoren der Translation in Escherichia coli
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
111 S.: Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Claudio Gualerzi ,
Andrea Barta
AC Nummer
AC08447318
Utheses ID
10756
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |