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A directed evolution approach to engineering oxygen resistant Fe-Fe hydrogenases
Gerald Grandl
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Karl Kuchler
DOI
10.25365/thesis.12389
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29369.29137.759966-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Diese Arbeit stellt einen Ansatz vor eine künstliche Selektion für FeFe-Hydrogenasen in E. Coli zu entwerfen, und damit große Bibliotheken mutierter Hydrogenasen auszusortieren, mit dem Ziel Mutanten mit einer erhöhten Halbwertszeit in aerober Umgebung zu isolieren.
Die biologische Herstellung von Wasserstoff durch Kopplung von Photosynthese und Hydrogenasen ist ein vielversprechender Ansatz, der allerdings Sauerstofftolerante Hydrogenasen voraus setzt. Für einen Ansatz mittels gerichteter Evolution müssen große Bibliotheken zufällig mutierter Varianten eines Enzyms hergestellt werden und von diesen dann solche auszuwählen, die eine erhöhte Funktionalität in dem erwünschten Parameter aufweisen – im Fall diese Projektes eine erhöhte Aktivität von Hydrogenasen in erhöhten Sauerstoffpartialdrücken. Gesetzt den Fall, dass eine Selektion zum herausfiltern erwünschter Mutationen angewendet werden kann ist gerichtete Evolution die leistungsfähigste Methode für die Entwicklung neuer Proteine.
Zu diesem Zweck wurde im Silver -Lab ein E. Coli Stamm entwickelt, dessen Wachstum auf eine aktive Hydrogenase für die Herstellung von Cystein und Methionin angewiesen ist. Eine künstliche Elektronentransportkette transferiert Elektronen von der Hydrogenase zu einer transgenen Sulfit-Reduktase, wodurch Sulfit reduziert und somit verwendet werden kann und das Wachstum unter selektiven Bedingungen (fehlender reduzierter Schwefel) stark erhöht wird.
Ein Protokoll zur Herstellung großer Mutanten-Bibliotheken von verschiedenen Hydrogenasen mittels fehlerhafter-PCR und deren aussortieren in dem synthetischen Selektionsstamm bei verschiedenen Sauerstofflevels wurde entwickelt. Weiters wurden verschiedene knock-out-Stämme um die Selektivität des Sortierungsprozesses zu erhöhen erzeugt sowie alternative Ansätze die Selektivität zu erhöhen getestet.
Nach der Charakterisierung möglicher Treffer aus den Wachstumsuntersuchungen wurden die Aktivitäten der Mutanten mit in vivo und in vitro Ansätzen gemessen. Außerdem wurde ein Protokoll zur biochemischen Aufreinigung der Hydrogenasen angewendet.
Mehrere Mutanten wurden aus den Wachstumsuntersuchungen isoliert. Die meisten wiesen eine stark verminderte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp auf. Auch ihre Halbwertszeiten in O2-atmosphere waren nicht erhöht. Das legt den Schluss nahe, dass das Ziel das Wachstum von E. Coli streng an Hydrogenaseaktivität zu koppeln nicht geglückt ist und wir daher nicht in der Lage waren, O2-resistente Hydrogenasen zu isolieren. Dennoch stellt das Projekt, als ein erster Ansatz einer Selektion zur Entwicklung verbesserter Hydrogenasen und einer der ersten Versuche Hydrogenasen weiterzuentwickeln eine sehr innovative Methode dar und unsere Ergebnisse gewähren wertvolle Einsichten in die Herausforderungen und Hindernisse die es zu meistern gilt um letztendlich erfolgreich Hydrogenasen – und biologische Systeme im Allgemeinen – weiterzuentwickeln.
Abstract
(Englisch)
This thesis presents an approach to design an artificial selection for hydrogenase function in E. coli, and use it to screen large mutant libraries if Fe-Fe hydrogenases, with the aim of isolating mutants with an increased half-life in aerobic environments.
The biological production of hydrogen by the direct connection of photosynthesis to hydrogenases is a promising option for renewable energy but requires oxygen-tolerant hydrogenases.
A directed evolution approach entails making large libraries of randomly mutated versions of an enzyme and then selecting variants that have an increased functionality for the desired parameter – in our case hydrogenase activity in increased O2 partial pressures. Directed evolution is the most powerful tool available to protein engineering, provided a system to select for beneficial mutations can be applied.
To that end an E. coli strain has been developed at the Silver lab that is dependent upon an active hydrogenase for cysteine and methionine synthesis. An artificial electron transport pathway shuttles electrons from the hydrogenase to a transgenic Sulfite-reductase, allowing the reduction and incorporation of sulfite, greatly improving growth on selective media (lacking reduced sulfur).
A protocol to generate large plasmid libraries of mutated hydrogenases of different origins using error-prone PCR and screen them in the artificial selection strain at different O2-levels was developed. Also knock-out strains to increase the selectivity of the screening process were generated and alternative approaches to improve the selectability of hydrogenases in our system as well as to increase the range of selectable oxygen levels were developed. Characterization of putative hits by growth assays was followed by measuring activities of hydrogenases using both in vitro and in vivo assays in order to characterize promising mutants. A protocol for the anaerobic purification of hydrogenases was also applied.
Several mutants could be isolated from the growth assays, most of which were active but showed reduced activity compared to wild type. Their half-lives in O2 were not improved either. This suggests that the system we made did not achieve the desired goal of linking growth of E. coli to hydrogenase activity and we were not able to isolate an O2-resistant hydrogenase. However, as a first attempt to engineer a selection for hydrogenases and one of the first attempts at engineering Fe-Fe hydrogenase at all our approach uses innovative methods and our findings provide valuable insight into the challenges and obstacles to be overcome to ultimately be successful in engineering new function in hydrogenases, as well as biological systems at large.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
directed Evolution Fe-Fe hydrogenases synthetic biology
Schlagwörter
(Deutsch)
gerichtete Evolution Fe-Fe Hydrogenasen synthetische Biologie
Autor*innen
Gerald Grandl
Haupttitel (Englisch)
A directed evolution approach to engineering oxygen resistant Fe-Fe hydrogenases
Paralleltitel (Deutsch)
Ein Ansatz der Verwendung gerichteter Evolution zur Entwickling Sauerstoff-resistener Fe-Fe Hydrogenasen
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
74 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Karl Kuchler
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC08472301
Utheses ID
11169
Studienkennzahl
UA | 490 | | |