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mRNA and protein expression profiling of CD4+/HLADR-/CD25- Th-cell populations following CD2 stimulation

Clemens Priemer

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Raute Sunder-Plassmann

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DOI

10.25365/thesis.12601

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29871.52091.649362-9

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

CD2, auch E rosette receptor, LFA2 (leukocyte function antigen) und T11 genannt, ist ein membranständiges Glykoprotein und gehört zur Immunglobulin Superfamilie. Es ist ein früher T-Zell Marker und wird auch auf NK-Zellen exprimiert. In vivo bindet humanes CD2 seinen Liganden CD58 (LFA3) an Antigen Präsentierenden Zellen und ermöglicht dadurch T-Zellen, auf sehr geringe Antigen Konzentrationen zu reagieren. Gleichzeitig werden durch diese Interaktion kostimulatorische Signale in T-Zellen induziert, die an der Regulation der Zytokin-Produktion beteiligt sind, Zytolyse vermitteln, Apoptose von aktivierten peripheren T-Zellen inhibieren und T-Zell Anergie regulieren. Ziel der Studie war es, die Wirkung von CD2 Stimulation auf T-Zellen, vor allem CD4 positive Helferzellen, auf mRNA und Protein Expression zu untersuchen, da viele Mechanismen in diesem Zusammenhang noch nicht ausreichend geklärt sind. Aufgereinigte CD4+ /HLADR- /CD25- T-Zellen wurden bereits mit CD2 Antikörpern stimuliert, und mit Hilfe von Amplichip mRNA expressions-Arrays wurden Veränderungen der mRNA Expression im Vergleich zu unstimulierten, sowie zu Anti-CD3 stimulierten CD4+ /HLADR- /CD25- TZellen analysiert. Kandidaten-Gene mit deutlich unterschiedlichem mRNA Expressionslevel wurden für weitere Untersuchungen mit Hilfe von TaqMAN Assays ausgewählt. In dieser Studie wurden einige Gene, deren unterschiedliche mRNA Expression mittels TaqMAN bestätigt wurde und für deren Proteine kommerzielle Antikörper zu Verfügung stehen, genauer untersucht. Die in diesem Zusammenhang untersuchten Gene, beziehungsweise Proteine sind: CD200 (OX2/MOX2): Teil der Immunglobulin Familie, und ein Zelloberflächen Glykoprotein welches in lymphoiden, neuronalen und Endothelzellen exprimiert wird. Während die mRNA Daten auf eine recht schnell induzierte Transkription hingewiesen haben, konnten wir in den Western Blot Experimenten jedoch kaum Protein nachweisen. CD137L: Gehört zur Familie der Tumor Nekrose Faktor Rezeptoren und liefert kostimulierende Signale an T-Lymphozyten. CD137 wird auf aktivierten T-Zellen exprimiert und bindet den Liganden CD137L, den man auf B-Zellen, Makrophagen und Dendritischen Zellen findet. Solche Interaktionen sind in die Antigen Präsentation und die Bildung von Zytotoxischen T-Zellen involviert. Es war uns im Rahmen der Experimente möglich diesen Liganden erstmals auf T-Zellen nachzuweisen, und die gesteigerte mRNA Expression zumindest teilweise zu verifizieren, was eine mögliche neue Einsicht in die Regulation von T-Zellen untereinander zulässt. aPak (Pak1 Kinase): Mitglied der PAK Kinase Familie (bestehend aus 6 Isoformen), die unter anderem eine sehr wichtige Rolle in Signalwegen von T-Zellen spielen. Unsere mRNA Daten zeigten eine gesteigerte Transkription von Pak1 nach anti-CD2-Stimulation, die wir auch auf Protein Ebene nachweisen konnten. NCK 1/2: Ein SH2/3 Adaptor Protein, welches eventuell auch für den CD2 Signalweg relevant sein könnte, da wir zumindest auf mRNA Ebene eine leichte Steigerung nachweisen konnten. Die Proteinkonzentration hingegen wird kaum durch CD2 Stimulation beeinträchtigt.

Abstract

(Englisch)

CD2, also called E rosette receptor, LFA2 (leukocyte function antigen), and T11, is a membrane associated glycoprotein and belongs to the immunoglobulin superfamily. It functions as an early T-cell marker, and is also expressed on NK-cells. In vivo, human CD2 binds its ligand CD58 (LFA3), situated on APCs (antigen presenting cells), thus enabling T-cells to respond to very low antigen concentrations. Simultaneously, CD2 induces co-stimulatory signals in T-cells, which are involved in cytokine production, mediate cytolysis, inhibit apoptosis of activated peripheral T-cells and regulate T-cell anergy. The goal of this study was to examine the effect of CD2 stimulation on T-cells, particularly CD4 positive helper cells, via mRNA and protein expression patterns, to shed light on mRNA and protein expression levels differentially upregulated upon aCD2 stimulation and to identify signalling or effector molecules so far unknown to be involved in CD2 mediated T-cell activation. Purified CD4+ /HLADR- /CD25- T-cells were previously stimulated with anti- CD2 antibodies and utilizing Amplichip mRNA expression arrays changes in mRNA expression were compared to both unstimulated and anti-CD3 stimulated CD4+ /HLADR-/CD25- T-cells. Candidate genes with differential mRNA expression levels were selected for further analysis using TaqMAN assays. In this study, 4 genes were further investigated for alteration in their respective protein levels following CD2 stimulation: OX2 (CD200/MOX2): A member of the immunoglobulin super-family, and a membrane associated glycoprotein expressed in lymphoid, neuronal and endothelial tissue. While our mRNA data suggested an increased transcription rate, we were not able to detect proportional amounts of protein during the Western blot experiments to support these findings. CD137L: A member of the TNF (tumor necrosis factor) receptor family, responsible for delivering co-stimulatory signals in T-lymphocytes. CD137 is expressed on all activated T-cells and binds to its ligand CD137L which is found on B-cells, macrophages and dendritic cells. This interaction is involved in antigen presentation and in the development of cytotoxic T-cells. During this study, we were able to demonstrate the presence of this ligand on T-cells for the first time, and confirmed the increased mRNA expression rate, at least partly. This might give a new insight into the subject of self regulating T-cell populations. aPak (Pak1 kinase): A member of the PAK kinase family (comprising 6 isoforms) which, among other functions, plays an important role in T-cell signalling. Our mRNA data indicated an increase in mRNA transcription upon CD2 stimulation, which we were also able to confirm on the protein level. NCK 1/2: A member of the SH2/3 adapter protein family, might be part of the CD2 pathway, since we were able to show a slight increase in the mRNA expression. The protein concentration, however, did only change little, if at all, following CD2 stimulation. in antigen presentation and in the development of cytotoxic T-cells.

Autor*innen

Clemens Priemer

Haupttitel (Englisch)

mRNA and protein expression profiling of CD4+/HLADR-/CD25- Th-cell populations following CD2 stimulation

Paralleltitel (Deutsch)

mRNA und Protein Expressios-Profiling von CD4+/HLADR-/CD25- Th-zell Populationen nach CD2 Stimulation

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

103 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Raute Sunder-Plassmann ,

Erwin Ivessa

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08746578

Utheses ID

11366

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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Schlagwörter