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Assigning specific roles to the RNA-binding proteins Pumilio2 and Staufen2 in the regulation of neuronal RNAs

Lucia Schoderböck

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Michael Kiebler

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29306.10774.300455-9

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

RNA Lokalisierung ist ein häufig verwendeter Mechanismus um Genexpression zu regulieren. Dadurch wird verschiedenen Zellen die Möglichkeit gegeben, Protein auf bestimmte subzelluläre Domänen zu verteilen und Zellpolarität zu etablieren. In Neuronen dienen RNA Lokalisierung und lokale Translation in Axonen und Dendriten dazu, um die Proteinzusammensetzung in Wachstumskegeln und an postsynaptischen Stellen ständig zu modifizieren und auf Reize aus der zellulären Umwelt zu antworten. Dadurch kommen ihnen wichtige Rollen beim Auswachsen von Axonen, dem Finden der Axonpfade, dendritischer Verzweigung, sowie der Morphogenese dendritischer Dornenfortsätze zu. Außerdem tragen die Lokalisierung von mRNAs nahe Synapsen, sowie die strenge räumliche und zeitliche Kontrolle der Translation zur autonomen, unabhängigen und schnellen Modifikation einzelner Synapsen bei. So ist RNA Lokalisierung von höchster Wichtigkeit für Mechanismen in Lernen und Gedächtnisbildung und fand daher in letzter Zeit zunehmend Interesse. mRNAs werden in translationell reprimierter Form in Ribonukleoprotein-Partikeln (RNPs) an jene Stellen transportiert, an denen sie benötigt werden. Die Zusammensetzung neuronaler Transport-RNPs, die Funktionen spezifischer Komponenten, sowie die Mechanismen des RNA Transports in Richtung von Axonen und Dendriten, sowie deren translationelle Kontrolle sind noch Gegenstand von Diskussionen. In dieser Arbeit untersuchte ich die funktionellen Rollen bestimmter RNP Komponenten im Kontext von Translations-Kontrolle und/oder RNA Stabilität während der RNA Lokalisierung. Zusätzlich habe ich Werkzeuge generiert, die für die Untersuchung von microRNA-abhängiger Translations-Kontrolle und die Isolierung von neuen RNA-bindenden Proteinen, die im RNA Transport beteiligt sind, notwendig sind. In meiner Arbeit konnte ich zeigen, dass Säuger-Pumilio2 (Pum2) spezifisch die Translation des Initiationsfaktors eIF4E in Neuronen reguliert. Erhöhte bzw. verminderte Mengen an eIF4E selbst beeinflussen die Entwicklung von Dendriten und die Morphologie dendritischer Dornenfortsätze in hippokampalen Neuronen, ähnlich den Effekten, die für Pum2 beobachtet wurden. Ich folgere daraus, dass die Effekte, die aufgrund erhöhter Pum2-Mengen auftreten, nicht direkt durch Pum2 verursacht sein könnten, sondern durch die translationelle Regulation anderer Faktoren, die an der neuronalen Entwicklung und Funktion beteiligt sind. Das Doppelstrang-RNA bindende Protein Staufen2 (Stau2) spielt eine wichtige Rolle bei der mRNA-Lokalisierung. Für Säugetier-Stau2 sind bisher keine spezifischen, direkt interagierenden mRNAs bekannt, und auch die Funktion von Stau2 ist unklar. Hier zeige ich, dass Stau2 in allen Neuriten sich entwickelnder Neuronen lokalisiert ist, wobei es sowohl in den Wachstumskegeln zukünftiger Dendriten als auch Axone vorkommt. Das Aktin-Zytoskelett wird durch das Ausschalten von Stau2 beeinträchtigt. Da die mRNA des Aktin-Regulators RhoA in Stau2 Immunpräzipitationen angereichert war, untersuchte ich, ob RhoA das funktionelle Bindeglied zwischen der Rolle von Stau2 und seinem Effekt auf das Aktin-Zytoskelett sein könnte. Eine Verminderung von Stau2 führte zu erhöhten RhoA mRNA Mengen, sowie zu erhöhter Expression eines EGFP-RhoA Konstrukts. Da vorläufige Daten im Labor darauf hindeuten, dass verminderte Mengen an Stau2 zu einem Defekt beim Auswachsen der Axone führen, legen meine Daten einen neuen Mechanismus für Staufen in auswachsenden Axonen nahe, der auf der Regulierung des Zytoskeletts via Stabilisierung der β-actin mRNA und dem Effekt auf RhoA basieren könnte. Zusammenfassend gelang es mir in dieser Arbeit, die Funktionsweise zweier wichtiger RNA-bindender Proteine, Pum2 sowie Stau2, näher zu definieren. Ob diese Funktionen auch auf die Interaktion von Pum2 und Stau2 mit anderen mRNAs zutreffen, wird in künftigen Projekten bearbeitet werden.

Abstract

(Englisch)

RNA localization is a widely used mechanism to regulate gene expression. It provides various cells with a means to target proteins to distinct subcellular compartments and establish cell polarity. In neurons, RNA localization and local translation in axons and dendrites allow growth cones and postsynaptic sites to instantly refine their protein composition in response to environmental cues. Consequently, these mechanisms critically contribute to axon growth and pathfinding, dendritic branching, as well as dendritic spine morphogenesis. Furthermore, localization of mRNAs near synapses, followed by tight control of their translation in space and time, contributes to their autonomous, independent and rapid modifications. It is therefore of particular importance for mechanisms of learning and memory and has recently attracted emerging interest. mRNAs are transported in ribonucleoprotein particles (RNPs) to the sites of need in a translationally repressed form. The composition of neuronal transport RNPs, the function of specific components, the mechanisms of RNA transport towards axons and dendrites and their translational control are still under debate. In this work, I investigated the functional roles of two key RNP components in the context of translational control and/or RNA stability in RNA localization. In addition, I generated tools for the investigation of microRNA-dependent translational control and isolation of novel RNA-binding proteins involved in RNA transport and localization. In the first part of my thesis, I show that mammalian Pumilio2 (Pum2) controls the expression of the key initiation factor eIF4E in neurons. Furthermore, eIF4E misregulation itself has effects on dendrite development and dendritic spine morphology of hippocampal neurons similar to those observed upon misregulation of Pum2. This led me to conclude that the effects observed upon Pum2 misregulation might not be caused by direct action of Pum2, but by translational regulation of factors involved in neuronal development and function. In the second part, I further characterized the mammalian double-stranded RNA-binding protein Staufen2 (Stau2), which has been implicated in mRNA localization. For Stau2, no direct target mRNAs are known so far, and its physiological role remains unclear. My data demonstrate that Stau2 is localized to all neurites of developing neurons as distally as in growth cones of both future dendrites and axons. The actin cytoskeleton was affected upon loss of Stau2. As the mRNA of the actin cytoskeleton regulator RhoA was found enriched in Stau2 immunoprecipitations, I investigated if Stau2 could affect the actin cytoskeleton indirectly via RhoA, potentially representing a functional link between the role of Stau2 and its effect on the actin cytoskeleton. Depletion of Stau2 led to increased RhoA mRNA levels and to increased expression of an EGFP-RhoA construct. In light of preliminary data in the lab that loss of Stau2 leads to defects in axon outgrowth, a novel mechanism for Stau2 in axon outgrowth emerges that could be based on regulation of the cytoskeleton via stabilization of β-actin mRNA and an effect on RhoA. Taken together, my work has shed new light on the roles of two prominent RNA-binding proteins, Pum2 and Stau2, in distinct steps of neuronal RNA localization. Whether those functions also apply to other targets of Pum2 and Stau2 will be addressed in future work.

Autor*innen

Lucia Schoderböck

Haupttitel (Englisch)

Assigning specific roles to the RNA-binding proteins Pumilio2 and Staufen2 in the regulation of neuronal RNAs

Paralleltitel (Deutsch)

Bestimmung spezifischer Rollen der RNA-bindenden Proteine Pumilio2 und Staufen2 in der Regulation neuronaler RNAs

Publikationsjahr

2010

Umfangsangabe

153 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Friedrich Propst ,

Stefan Hüttelmaier

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.15 Zellbiologie

AC Nummer

AC08540091

Utheses ID

11401

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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