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Mechanism of gene regulation by STATs and interacting transcriptionfactors
Matthias Farlik
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Thomas Decker
DOI
10.25365/thesis.12687
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29155.38346.771269-9
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Auf der Basis existierender Publikationen, werden zwei große Gruppen von Genen, nach dem Prinzip ihrer Regulation, voneinander unterschieden. Eine spezielle Kathegorie von Genen wird im Zuge einer ersten/primären Antwort auf einen Stimulus gebildet und kann als PRGs (primary response genes) zusammengefasst werden. Als Unterscheidungskriterium von jenen Genen die zur Gruppe der sekundär exprimierten Gene (SRGs – secondary response genes) gerechnet werden, wird das Vorhandensein der RNA Polymerase II und die Histonmodifikation H3K4me3 am Promoter der betreffenden Gene, bereits vor dem Eintreffen des Stimulus, herangezogen. PRGs zeichnen sich durch einen sehr hohen Anteil, sowohl von RNA Pol II als auch H3K4me3 aus, wohingegen SRGs erst durch einen aktiven Prozeß im Verlauf des Stimulierens, das Binden der RNA Pol II am Promoter des zu regulierenden Gens gewährleisten müßen, einhergehend mit gesteigerter H3K4me3. Dieser zusätzliche Aufwand und das hierfür benötigte Vorhandensein von mehreren aktiven Transkriptionsfaktoren, ist in weiterer Folge, für die späte Expression dieser Gruppe von Genen, im Vergleich zu der Gruppe der PRGs, verantwortlich. Um die Mechanismen der Regulation dieser spät-exprimierten Gene zu analysieren konzentrierten wir uns auf jene Gene, die als Antwort auf Interferone exprimiert werden, und somit unter der Kontrolle der STAT (Signal transducers and activators of transcription) Familie von Transkriptionsfaktoren liegen. Zum Einen behandelten wir Zellen in unseren Untersuchungen mit IFNbeta (Interferon), zum anderen analysierten wir die Effekte einer weiteren Klasse von Interferonen, der Typ I Interferone am Beispiel IFNbeta, im Zuge der Infektion von Makrophagen mit dem Gram+, fakultativ intrazellulärem Bakterium Listeria monocytogenes. Makrophagen produzieren als Antwort auf eine Infektion mit Listerien große Mengen IFNbeta, welches wiederum, im Zusammenwirken mit anderen Signalen, für die Regulation von Genen benötigt wird, die an der Abwehr der Infektion beteiligt sind.
Als Paradebeispiel für die große Gruppe der IFNbeta regulierten Gene betrachteten wir die Regulation von Gbp2 (guanylate binding protein). Aufbauend auf bereits bestehende Arbeiten im Labor, welche STAT1 und IRF1 (interferon regulatory factor) als die wichtigsten Transkriptionsfaktoren identifizierten, und darüber hinaus die Bedeutung der Ser 727 Phosphorilierung von STAT1, für die Rekrutierung von HDACs (histone deacetylases) und CPB/p300 (CREB – cyclic AMP response element binding protein – binding protein) an den Gbp2 promoter beschrieben, entdeckten wir die Abhängigkeit der RNA Pol II Rekrutierung von der Anwesenheit von IRF1 am Promoter. Zusätzlich zu IRF1 identifizierten wir IRF7 als noch nicht beschriebenen Schlüßelfaktor für die Regulation von Gbp2, wie auch andere über einen ISRE (interferon stimulated response element) Konsensus regulierte Gene, im Zuge der IFNgamma Antwort. Im Gegensatz zu IRF1, benötigt IRF7 für seine Aktivierung, auch im Kontext der IFNgamma Antwort, die Aktivität der S/T Kinase TBK1 (TANK - TRAF family member associated NFkappaB – nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells - activator - binding kinase). IRF7 Phosphorylierung durch TBK1 zeigte sich als notwendig für die Regulation von Gbp2 und anderen Genen, deren Abwesenheit führte jedoch nicht zu einem Verlust der IRF7 Promoterbindung. SOCS1 Expression zeigte sich im Gegensatz zu GBP2, unabhängig von der IRF7 Phosphorylierung durch TBK1. Die verwandte S/T Kinase IKKepsilon (IkappaB – inhibitor of NFkappaB - kinase) hatte im Gegensatz zu TBK1, einen reprimierenden Effekt auf die GBP2 Expression. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass phosphoryliertes wie unphosphoryliertes IRF7 an der Genregulation von ISRE regulierten Genen, nach Behandlung mit IFNgamma beteiligt ist.
Eine weitere Gruppe von Genen innerhalb der SRGs benötigt zusätzlich zu den Faktoren, welche über Interferone aktiviert werden, noch die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren über andere Signaltransduktionswege, und deren Zusammenspiel um eine effiziente Expression zu erfahren. Ein Beispiel für diese speziell regulierten Gene ist das Nos2 Gen, welches für die Bildung der iNOS (inducible nitric oxide synthase) verantwortlich ist und nach Infektion durch verschiedenste intrazelluläre Pathogene, wie Listerien, gebildet wird. Es benötigt die Aktivierung von NFkappaB im selben Ausmaß wie die IFN abhängige Aktivierung von ISGF3 (interferon stimulated gene factor – ein Komplex aus STAT1, STAT2, und IRF9 welcher im Zuge der Typ I IFN Signaltransduktion aktiviert wird, zum Beispiel IFNbeta).
Im Zuge der detailierten Analyse des Mechanismus der iNOS Regulation, konnten wir zeigen, dass die Bindung von NFkappaB an den Nos2 Promoter jener von ISGF3 vorangeht. NFkappaB zeichnet dafür verantwortlich, dass der basale Transkriptionsfaktor TFIIH mit der assoziierten Kinase CDK7 (cyclin dependent kinase), welcher die RNA Pol II am Ser5 des CTD (C-terminal domain) phosphoriliert, an den Promoter rekrutiert, und dort verankert wird. Dies erzeugt einen transkriptionellen Gedächtniszustand, der bestehen bleibt, auch wenn NFkappaB den Promoter wieder verlassen hat. Neben CDK7-TFIIH konnte auch das Rekrutieren von CDK9 p-TEFb (positive transcription elongation factor) als NFkappaB abhängig gezeigt werden. CDK9 aktivität ist notwendig um die NELF (negative elongation factor) abhängigen Blockade der Polymerase am Übergang zur Elongation aufzuheben. Dem Binden von CDK7 an den Promoter folgt die Bindung von TBP (TATA binding protein), und der Polymerase selbst, welche beide auf das Interferonsignal und die daraus resultierende Aktivierung von ISGF3 angewiesen sind. Die so geschaffene RNA Pol II Bindung kann schließlich die iNOS Transkription auslösen. Die beiden Transkriptionsfaktoren kooperieren in der Regulation des Nos2 Gens durch das kombinierte Rekrutieren von verschiedenen Faktoren des PIC (pre initiation complex) und der RNA Pol II selbst.
Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass nicht nur das Rekrutieren der Polymerase selbst ein limitierender Schritt zur Transkription ist, sondern auch das Rekrutieren von Kofaktoren einer strengen Kontrolle unterliegt, und von verschiedenen Transkriptionsfaktoren gesteuert wird. Diese Hypothese findet, anhand unserer Daten, nicht nur Anwendung bei Genen die im Zuge eines einzigen Stimulus exprimiert werden, wie im Fall von IFNgamma aktiviertem STAT1 und IRF1, sondern gilt im selben Maße auch für Gene deren Expression die Zusammenarbeit mehrerer Signaltransduktionswege bedingt, wie am Beispiel der iNOS für NFkappaB und ISGF3 gezeigt. Die getesteten Transkriptionsfaktoren vermitteln die Bindung von Faktoren des PIC und der Polymerase selbst um diese dann zur Expression zu veranlassen
Abstract
(Englisch)
According to recent studies PRGs (primary response genes) that are expressed rapidly after providing the activating stimulus are characterized by the initial presence of paused polymerases and high levels of H3K4me3 at their promoter. In contrast, SRGs (secondary response genes) are regulated by the active recruitment of RNA Pol II (RNA polymerase II), requiring the interplay of transcription factors and co-factors to induce transcription, and are therefore delayed in their expression, compared to PRGs. To examine the mechanisms driving the expression of SRGs, we focused on the regulation of STAT-regulated genes, stimulated by IFNgamma (Interferon) or IFNbeta. Effects of the latter were studied in macrophages infected with the Gram+, facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes. Infected cells produce IFNbeta to synergize with additional pathways in the upregulation of host-defense genes.
To examine the role of STAT1 (signal transducer and activator of transcription) in the regulation of IFNgamma-induced SRGs, we focused on the regulation of the Gbp2 (guanylate binding protein) gene. Previous work in the lab had shown that Gbp2 belongs to a subgroup of genes that require both STAT1 and IRF1 (interferon regulatory factor) for transcriptional induction upon IFNgamma treatment and that recruitment of HDACs (histone deacetylase) and CBP/p300 (CREB – cyclic AMP response element binding protein – binding protein) to the Gbp2 promoter directly depends on the presence of STAT1 and its phosphorylation on Ser727. We could further demonstrate that IRF1 binding was needed for the recruitment of RNA Pol II. Moreover, IRF7 was involved in the regulation of Gbp2 and other ISRE (interferon stimulated response element)-driven genes after IFNgamma treatment.
This finding is novel, since IRF7 was not known to be expressed upon IFNgamma treatment and to participate in the regulation of interferon-induced genes. Contrasting IRF1, IRF7 function in this context relied on the presence and constitutive activity of the S/T kinase TBK1 (TANK - TRAF family member associated NFkappaB – nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells - activator - binding kinase). TBK1-mediated IRF7 phosophorylation was required for GBP2 expression, but did not alter IRF7 binding to the Gbp2 promoter. Expression of the Socs1 gene did require the presence of IRF7, but not its phosphorylation by TBK1. In contrast to TBK1, the related S/T kinase IKKepsilon (IkappaB – inhibitor of NFkappaB - kinase) repressed IRF7 activity to induce GBP2 expression. These findings indicate that phosphorylated, aswell as unphosphorylated IRF7 participates in the regulation of ISRE-driven gene expression after IFNgamma treatment.
A distinct subset of SRGs requires the cooperation of signals derived from IFNs as well as additional signals derived from the infecting pathogen to acquire full-fledged transcriptional activity. Paradigmatic for this group is the Nos2 gene, encoding iNOS (inducible nitric oxide synthase), which is highly upregulated in macrophages during infections with various pathogens. In this study we show that the transcription factors NFkappaB and ISGF3 (interferon stimulated gene factor - a complex of STAT1, STAT2, and IRF9 which is formed and activated in response to type I IFNs, like IFNbeta) cooperate in the induction of iNOS and iNOS like genes in macrophages, infected with Listeria monocytogenes.
We were able to demonstrate that, NFkappaB preceded ISGF3 at the Nos2 promoter and generated a transcriptional memory effect by depositing basal transcription factor TFIIH with the associated CDK7 (cyclin dependent kinase) kinase for serine 5 phosphorylation of the RNA Pol II - CTD (carboxyterminal domain). Moreover, p-TEFb (positive transcription elongation factor), a complex containing the kinase CDK9, which is required to release the Pol II enzyme from the NELF (negative elongation factor) dependent elongation block, was similarly deposited in an NFkappaB dependent manner. Deposition of CDK7-TFIIH at the proximal Nos2 promoter, was followed by TBP (TATA binding protein) and RNA Pol II binding, which were found to be recruited in an ISGF3 dependent manner. Hence, the two transcription factors cooperate in our infection model by assembling different components of the PIC (pre-initiation complex), and the RNA-Pol II enzyme itself, in order to induce iNOS transcription. Taken together our results indicate that at least for some SRGs not only the recruitment of RNA Pol II is a limiting step to induce gene expression, but also the recruitment of co-factors follows strict rules and results from the division of labor between different transcription factors. According to our findings this hypothesis is valid for transcription factors that are activated within a single pathway, such as STAT1 and IRF1, but also those activated through different signaling pathways, like NFkappaB and ISGF3. Collectively these proteins converge at the promoters of a subset of infection-induced genes to assemble the PIC – Pol II complex, and engage the Pol II enzyme in active transcription.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
transcription transcriptionfactors polymerase generegulation interferons Listeria transcriptional induction molecular memory
Schlagwörter
(Deutsch)
Transkription Transkriptionsfaktoren Polymerase Genregulation Interferone Listerien Transkriptionsinitiation molekulares Gedächtnis
Autor*innen
Matthias Farlik
Haupttitel (Englisch)
Mechanism of gene regulation by STATs and interacting transcriptionfactors
Paralleltitel (Deutsch)
Mechanismen der Genregulation durch STATs und interagierenden Transkriptionsfaktoren
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
135 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Thomas Decker ,
Christian Seiser
AC Nummer
AC08540084
Utheses ID
11432
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |