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Nachweis von Erdnuss- und Sesamallergenen mittels PCR und Real-time PCR
Kristina Rilling
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Helmut Mayer
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29295.59888.483563-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Aktuelle Studien berichten, dass die Prävalenz von Lebensmittelallergien in industrialisierten Ländern steigt. Da die Aufnahme von Erdnüssen und Sesam bei sensibilisierten Personen oft schwere allergische Reaktionen zur Folge hat, sind zuverlässige Nachweismethoden für Allergene in Lebensmitteln unerlässlich. In der Lebensmittelanalytik nimmt die Bedeutung von molekularbiologischen Methoden zu, daher lag der Schwerpunkt dieser Diplomarbeit in der Optimierung von PCR- und Real-time PCR-Protokollen.
Diese Arbeit hatte zum Ziel, das Erdnuss-Allergen Ara h 3 und das Sesam-Allergen Ses i 1 mittels PCR und Real-time PCR nachzuweisen. Aus Erdnuss- bzw. Sesamproben wurde mittels QIAGEN DNeasyR Tissue Kit (50) die DNA isoliert und ihre Konzentration durch fotometrische Messungen bei 260nm ermittelt. Die Qualität der isolierten DNA wurde über den Quotienten E260/E280 berechnet und führte zu dem Schluss, dass die DNA rein vorliegt und für weitere Analysen eingesetzt werden kann.
Um einen Überblick über die Spezifität der eingesetzten Primerpaare zu erlangen, wurden PCRs mit anschließenden Agarosegelelektrophoresen durchgeführt, mit dem Ergebnis, dass Arah3AF/Arah3ABR bei einer optimalen AT von 62°C ein 105 bp großes, für Erdnuss spezifisches Amplikon bildet, dass SesamPr1F/SesamPr1R (optimale AT 60°C) und SesamPr2F/SesamPr2R (optimale AT 58°C) sehr Sesam-spezifische Primerpaare, ohne Amplifikationen unspezifischer PCR-Produkte sind und, dass der Einsatz des Sesam-spezifischen Primerpaars SesF/SesR nur bei 65°C AT ohne der Bildung falsch-positiver PCR-Produkte möglich ist.
Eine Bestätigung der Spezifität und Daten über die Sensibilität der verwendeten Primerpaare wurden durch Real-time PCR Analysen erhalten. Arah3AF/Arah3ABR und SesamPr2F/SesamPr2R konnten bis zu 10000fache Verdünnungen der Ausgangs-DNA, was einer Konzentration von 19,5 pg/μl Erdnuss-DNA und 20 pg/μl Sesam-DNA entsprich, spezifisch detektieren. Mit SesamPr1F/SesamPr1R und SesF/SesR konnten keine respektablen Ergebnisse erzielt werden.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war es, optimale Reaktionsbedingungen für die Real-time PRC zu schaffen, indem zwei Temperatur/Zeitprogramme, verschiedene Annealingtemperaturen und –zeiten und unterschiedliche Reaktionsgefäße ausgetestet wurden.
Abstract
(Englisch)
Recent studies indicate that the prevalence of food allergy is increasing in industrialized countries. The intake of trace amounts of peanut or sesame can cause severe allergic reactions in sensitized individuals. Therefore, reliable detection methods for allergens in foods are essential. Because of the growing significance of DNA-based detection methods, this diploma thesis focuses on the improvement of PCR and real-time PCR protocols.
One aim of the study was to detect the peanut allergen Ara h 3 and the sesame allergen Ses i 1 with PCR and real-time PCR. As a first step, the DNA was extracted from crushed peanuts and sesame seeds with QIAGEN DNeasyR Tissue Kit (50) and quantified by measuring the absorbance at 260nm. The quality of the isolated DNA was determined by calculating the A260/A280 ratio.
To obtain a overview of the specificity of the selected primer pairs, PCRs with following agarose gel electrophoresis were used. The results showed that Arah3AF/Arah3ABR amplifies a peanut specific PCR product at optimized AT of 62°C, that SesamPr1F/SesamPr1R (AT 60°C) and SesamPr2F/SesamPr2R (AT 58°C) are characterized by high specificity to sesame and that the use of SesF/SesR is only possible at AT of 65°C without getting false-positive amplification products.
To approve specificity and identify sensitivity of the used primer pairs, real-time PCR analysis would be necessary. With Arah3AF/Arah3ABR and SesamPr2F/SesamPr2R a 10000fold dilution of the initial DNA (corresponding to 19,5 pg/μl peanut-DNA and 20 pg/μl sesame-DNA) could be detected specifically. Real-time PCR didn´t work with the primer pairs SesamPr1F/SesamP1R and SesF/SesR because of positively amplifying no template controls in each run.
The second focus of the diploma thesis was to optimize the reaction conditions for real-time PCR by testing two temperature-time programs, different annealing temperatures and periods and diverse reaction tubes.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
peanut allergen sesame allergen PCR real-time PCR
Schlagwörter
(Deutsch)
Erdnussallergen Sesamallergen PCR Real-time PCR
Autor*innen
Kristina Rilling
Haupttitel (Deutsch)
Nachweis von Erdnuss- und Sesamallergenen mittels PCR und Real-time PCR
Paralleltitel (Englisch)
Detection of peanut and sesame allergens with PCR and real-time PCR
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
VIII, 104 S.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Helmut Mayer
AC Nummer
AC08409103
Utheses ID
11457
Studienkennzahl
UA | 474 | | |