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In vitro Reconstitution of DegP-Omp complexes from Escherichia coli
Julia Leodolter
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Tim Clausen
DOI
10.25365/thesis.12782
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30247.34385.302954-4
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Ein wichtiger Prozess in zellulärer Proteinqualitätskontrolle ist das Überwachen von Faltungszuständen von Proteinen, da ent- oder fehlgefaltete Proteine Zellen durch die Bildung von potentiell giftigen Aggregaten gefährden. Das bifunktionelle Hitzeschockprotein DegP, ein Mitglied der HtrA Familie, fungiert sowohl als Protease, als auch als Chaperon und hat eine Schlüsselrolle in der Proteinqualitätskontrolle im Periplasma von E.coli inne. Zusätzlich ist DegP in der Biogenese von Außenmembranproteinen (outer membrane proteins, Omps) impliziert. Gemeinsam mit den periplasmatischen Chaperonen Skp and SurA soll DegP Omps durch das wässrige Periplasma leiten, um schädliche Aggregation zu verhindern.
Obwohl DegPs Funktion als Protease schon eingehend charakterisiert wurde, ist über seine Funktion als Chaperon und seine Beteiligung in der Biogenese von Omps noch nicht viel bekannt. DegP muss in Komplexen mit gefalteten Substraten biochemisch und strukturell analysiert werden, um seine Rolle als Chaperon auf einem mechanistischen Level zu verstehen. In dieser Arbeit rekonstituierten wir Komplexe von DegP mit gefalteten und ungefalteten Substraten in vitro und gewannen biochemisch Einblicke in DegPs mögliche Rolle als Proteinfaltungsfaktor in der Biogenese von Omps.
Wir beobachteten, dass DegP Komplexe mit ungefalteten OmpA und OmpC/F bildete, konnten aber keine Faltungsaktivität nachweisen. Allerdings bindet und schützt DegP gefaltete Omps, die aus der äußeren Membran extrahiert wurden. Zusätzlich zu den DegP-Omp Komplexen generierten wir Komplexe aus den Chaperonen Skp und SurA mit OmpA und OmpC/F. Dabei fanden wir heraus, dass DegP die Porine OmpC und OmpF gegenüber dem Strukturprotein OmpA als Substrate bevorzugte, während für Skp und SurA das Umgekehrte galt. Wir untersuchten eine der potenziellen Rolle von DegP in einer zweiten Ablaufebene der Biogenese von Omps als Qualitätskontrollmechanismus, wobei wir allerdings keinen Transfer des Proteins OmpA von Skp/SurA zu DegP nachweisen konnten. Außerdem analysierten wir mutmaßliche DegP Schnittstellen in OmpC/F Signalpeptiden und gewannen weitere Einblicke in DegPs Proteaseaktivität.
Die in dieser Arbeit präsentierten Daten unterstützen eine Rolle von DegP als Faltungsfaktor in der Biogenese von Omps nicht, aber die stabile Assoziation von DegP und gefalteten Omps untermauert seine Rolle als wichtiger Qualitätskontrollfaktor.
Die DegP-Omp Komplexe, die in dieser Arbeit generiert wurden, stellen eine wichtige Basis für weitere strukturelle Untersuchungen von DegP-Omp Komplexen dar. Ausserden wurden Fortschritte, DegPs Funktion als Chaperon betreffend, gemacht und mögliche Substratspezifitäten von DegP, Skp und SurA aufgedeckt. Dies bietet eine experimentelle Basis für die weitere Aufklärung des Chaperon-Netzwerks in der Biogenese von Omps.
Abstract
(Englisch)
Monitoring protein folding states is a crucial process in cellular protein quality control. Un- or misfolded proteins endanger cells by forming potentially toxic aggregates. The bifunctionial heat-shock protein DegP, a member of the HtrA family, functions both as a protease and a chaperone and plays a key role in protein quality control in the E.coli periplasm. Furthermore, it is implicated in outer membrane protein (Omp) biogenesis, together with the periplasmic chaperones Skp and SurA, which most likely shuttle Omps through the aqueous periplasm to prevent harmful aggregation.
Even though DegPs protease function is already characterized in depth, its chaperone function and its involvement in Omps biogenesis is not well understood. To mechanistically comprehend DegPs role as a chaperone we need structural and biochemical analyses of DegP complexed with folded substrates. In this work we reconstituted complexes of DegP with folded and unfolded Omp substrates in vitro and biochemically gained further insights into DegPs probable role as a folding factor in Omp biogenesis.
We found that DegP formed complexes with unfolded OmpA and OmpC/F, but observed no folding activity. However, DegP binds and protects folded Omps extracted from the outer membrane. Apart from DegP-Omp complexes, we generated complexes of the chaperones Skp and SurA with OmpA and OmpC/F. Thereby, we found that DegP preferred the porins OmpC and OmpF as substrate over the structural protein OmpA, while the opposite was true for Skp and SurA. We investigated a potential role of DegP as a second-step quality control mechanism in Omp biogenesis, however we detected no evidence of a transfer of OmpA from Skp/SurA to DegP. In addition, we analysed the putative DegP cleavage sites within the OmpC/F signal peptides and gained further insights into DegPs protease activity.
The data presented in this work does not support a role of DegP as a folding factor in Omp biogenesis, but its stable association with folded Omps fortifies DegPs role as an important quality control factor.
The DegP-Omp complexes generated in this work contribute an important basis for further structural investigation of DegP-Omp complexes. This work provides biochemical advancances on the chaperone function of DegP and suggests furthermore possible substrate specificities of DegP, Skp and SurA, offering an experimental basis for future elucidation of the chaperone network involved in Omp biogenesis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
DegP Skp SurA Omp periplasmic chaperones Omp biogenesis Protein quality control E.coli
Schlagwörter
(Deutsch)
DegP Skp SurA Omp periplasmatische Chaperone Omp Biogenese Proteinqualitaetskontrolle E.coli
Autor*innen
Julia Leodolter
Haupttitel (Englisch)
In vitro Reconstitution of DegP-Omp complexes from Escherichia coli
Paralleltitel (Deutsch)
In vitro Rekonstitution von DegP-Omp Komplexen aus Escherichia coli
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
108 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Tim Clausen
AC Nummer
AC08745886
Utheses ID
11514
Studienkennzahl
UA | 490 | | |