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Development of diagnostic PCR assays for typing and subtyping of the highly pathogenic bacterial taxa Brucella, Francisella and Yersinia pestis
Birgit Elisabeth Huber
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Hans-Jürgen Busse
DOI
10.25365/thesis.13067
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29402.31484.342065-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um diagnostische Schnelltests auf der Basis konventioneller PCR (Polymerase Kettenreaktion) zu entwickeln, die die Detektion und Unterscheidung jener Arten, Unterarten und Biovare der potentiell bioterroristisch nutzbaren Bakterien der Gattungen Francisella, Brucella und Yersinia erlauben, die noch nicht durch gängige Gel-basierte PCR-Tests erkannt werden. Referenzstämme und Feldisolate wurden mittels RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) und rep-PCR (gegen repetitive, nichtkodierende, intercistronische Abschnitte gerichtet) analysiert, um Regionen genetischer Variabilität zwischen den eng verwandten Arten, Unterarten und Biovaren der einzelnen Gattungen ausfindig zu machen. Mittels dieses Ansatzes wurden in den resultierenden RAPD Mustern spezifische PCR-Produkte gefunden. Diese Produkte wurden in E. coli kloniert und dann sequenziert. Sequenzunterschiede, die im Vergleich zu in Datenbanken hinterlegten Sequenzen identifiziert werden konnten, zusammen mit Informationen aus diversen Veröffentlichungen, wurden verwendet, um spezifische und robuste PCR Schnelltests zur Typisierung und Subtypisierung der Taxa Brucella und Francisella zu entwickeln. Weiters wurde ein PCR-Test entwickelt, um Yersinia pestis-ähnliche Yersinia pseudotuberculosis Stämme zu identifizieren.
Zusätzlich zu den allgemein gebräuchlichen PCR Tests wie der AMOS-PCR und einigen ihrer Varianten kann der neu entwickelte Brucella Ansatz Brucella neotomae, Brucella pinnipedialis, Brucella ceti und Brucella microti spezifisch detektieren. Darüber hinaus konnte der Test die Brucella abortus Biovare 1,2,4 von den Biovaren 3,5,6 und 9, sowie auch Brucella suis Biovar 1 von den Biovaren 3,4 und 2,5 unterscheiden. Ein im Rahmen dieser Arbeit entwickelter Francisella Multiplex-Ansatz differenzierte zwischen der neuen Art Francisella hispaniensis, Repräsentanten aller anderer Francisella-Arten und Unterarten, F. tularensis subsp. tularensis A.I und A.II Stämmen und Biovar japonica der Unterart F. tularensis subsp. holarctica. Der neu entwickelte Yersinia Triplex-Ansatz ermöglichte eine spezifische Unterscheidung von Y. pestis und atypischen Y. pestis-ähnlichen Y. pseudotuberculosis Stämmen und unterschied sie auch gleichzeitig von anderen Stämmen der Spezies Y. pseudotuberculosis.
Zur Evaluierung der entwickelten Tests war es unerlässlich, die taxonomische Stellung einer Reihe von Feldisolaten zu bestimmen. Im Laufe dieser Studie wurden deshalb zusammen mit Kollegen anderer Institute eine große Zahl an Feldisolaten von Brucella und anderen Vertretern der Familie Brucellaceae (Ochrobactrum, Pseudochrobactrum und Paenochrobactrum) wie auch von Francisella charakterisiert, wobei klassische mikrobiologische und chemotaxonomische Methoden sowie die Analyse konservierter Gene (rrs, recA, gyrB, groEL) und RAPD-PCR Anwendung fanden. In einigen Fällen wurden auch DNA-DNA Hybridisierungen durchgeführt, um den Speziesstatus von Stämmen eindeutig zu klären. Stämme, die keiner etablierten Art zugeordnet werden konnten, wurden dann als neue Art beschrieben; fünf Ochrobactrum Arten (O. haematophilum, O. rhizosphaerae, O. pituitosum, O. pseudogrignonense, O. thiophenivorans), zwei Pseudochrobactrum Arten (Ps. kiredjianiae, Ps. lubricantis), und eine Paenochrobactrum Art (Paenochrobactrum gallinarii), zwei Brucella Arten (B. microti, B. inopinata) und eine Francisella Art (F. hispaniensis).
Abstract
(Englisch)
The present study was conducted in order to develop rapid diagnostic assays on the basis of conventional PCR which allow detection and discrimination of species, subspecies and biovars of the potential bioterrorist agents Francisella, Brucella and Yersinia not targeted by the currently established gel-based PCR assays. Reference and field strains were analysed using RAPD and rep-PCR in order to find regions of genetic heterogeneity in the genomes of the closely related species, subspecies and biovars for each of the different genera. A number of promising differences could be found in the resulting RAPD fingerprints. Distinctive bands were cloned in E. coli and sequenced. Differences on the molecular level found through analysis of the obtained sequence data as well as genome comparisons, together with expedient information taken from previous external studies were used to develop specific and robust PCR assays for typing and subtyping of the taxa Brucella and Francisella as well as an assay that can identify atypical Yersinia pseudotuberculosis strains.
In addition to the commonly used PCR assays like the AMOS-PCR and some variants thereof, the developed Brucella assay specifically identified Brucella neotomae, Brucella pinnipedialis, Brucella ceti, and Brucella microti. Furthermore, it differentiated Brucella abortus biovars 1, 2, 4 from biovars 3, 5, 6, 9, as well as between Brucella suis biovar 1, biovars 3, 4, and biovars 2, 5. The Francisella multiplex-PCR developed in the course of this study distinguished between the novel Francisella species Francisella hispaniensis, representatives of all other Francisella species and subspecies, clades A.I and A.II of Francisella tularensis subsp. tularensis and Francisella tularensis subsp. holarctica biovar japonica. The novel Yersinia triplex assay allowed for a clear distinction between Yersinia pestis and Yersinia pestis-like Yersinia pseudotuberculosis strains and distinguished them from typical strains of Y. pseudotuberculosis.
For a molecular comparison of strains and to assure the specificity of the developed PCR assays, it was indispensible to determine unambiguously the taxonomic status of field strains using the available methods. In collaboration with colleagues from other institutes, a great number of field strains of Brucella and other representatives of the family Brucellaceae, including Ochrobactrum, Pseudochrobactrum and Paenochrobactrum, as well as strains of Francisella were therefore classified applying classical microbiological and chemotaxonomical methods, analyses of housekeeping genes (rrs, recA, gyrB, groEL), RAPD-PCR and partly also DNA-DNA hybridization. Strains that could not be assigned to a recognized species were proposed as novel species, leading to the description of two Brucella species (B. microti, B. inopinata), five Ochrobactrum species (O. pseudogrignonense, O. pituitosum, O. rhizosphaerae, O. haematophilum, O. thiophenivorans), two Pseudochrobactrum species (Ps. kiredjianiae, Ps. lubricantis), one Paenochrobactrum species (Paenochrobactrum gallinarii) and a novel Francisella species (F. hispaniensis).
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
polymerase chain reaction diagnostics biothreat agent sequence typing DNA-DNA hybridization multiplex PCR chemotaxonomy RAPD fingerprinting
Schlagwörter
(Deutsch)
Polymerase Kettenreaktion DNA-DNA Hybridisierung Multiplex PCR Chemotaxonomie
Autor*innen
Birgit Elisabeth Huber
Haupttitel (Englisch)
Development of diagnostic PCR assays for typing and subtyping of the highly pathogenic bacterial taxa Brucella, Francisella and Yersinia pestis
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung von PCR-Schnellmethoden zur Typisierung und Subtypisierung der hoch pathogenen Bakterientaxa Brucella, Francisella und Yersinia pestis
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
175 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Hans-Jürgen Busse
AC Nummer
AC08559512
Utheses ID
11755
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |