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NMDA-receptor functionality at the blood-brain barrier in vitro
Michael Freidl
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Christian Noe
DOI
10.25365/thesis.13096
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29311.19559.675455-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Eine Vielfältigkeit an Krankheitsprozessen und Zustände wie Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie, Epilepsie und Schlaganfall sind bedeutende pathologische Gegebenheiten in der heutigen Zeit. Obgleich diese Leiden durch verschiedene Mechanismen ausgelöst werden, teilen diese dennoch den NMDA-Rezeptor als gemeinsames Target. Von einer Anwesenheit und Beteiligung dieses Glutamat-gesteuerten Ionenkanals wird immer häufiger bei wichtigen regulatorischen Mechanismen an der Blut-Hirn-Schranke berichtet.
Das erste Ziel dieser Diplomarbeit war die Anwesenheit von NMDA-Rezeptor-Untereinheiten NR-1, -2A, -2B und -2C in der humanen Blut-Hirn-Schranken Zelllinie ECV304 durch Western-Blot-Analysen und Immunofluoreszenz-Mikroskopie zu bestätigen und zu untersuchen, um einen Überblick von möglichen Zusammensetzungen eines funktionellen NMDA-Rezeptors zu bekommen. Anschließend war die Etablierung eines 96-Well Plattenfluoreszenz-Assay zum messen des intrazellulären Ca2+-Spiegel, welcher als funktioneller Parameter einer NMDA-Rezeptoraktivierung gesehen werden kann, unser Ziel. Darüber hinaus wurden Methoden wie die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstandes (TEER) und Western-Blots durchgeführt, um den Einfluss einer Überstimulation oder Inhibition des NMDA-Rezeptors auf spezifische Blut-Hirn-Schranken Eigenschaften zu überprüfen. Die Anwesenheit aller vier untersuchten NMDA-Rezeptor Untereinheiten konnte in dem verwendeten in vitro Blut-Hirn-Schranken Model gezeigt, jedoch ihre Lokalisation innerhalb der Zellmembran, was als Voraussetzung für NMDA-Rezeptorfunktionalität als Ca2+-Kanal vermutet wird, nicht bewiesen werden. In Übereinstimmung zu diesem zeigten Messungen des Ca2+-Spiegel widersprüchliche Ergebnisse mit NMDA-Rezeptor-Agonisten. Für eine weitere Validierung des Testsystems wurden zusätzlich noch weitere intrazelluläre Ca2+-Spiegel-Modulatoren getestet, welche die Brauchbarkeit des Testset-ups bestätigten. Trotz allem konnten ungünstige Effekte von Glutamate auf die Blut-Hirn-Schranken-Integrität (TEER) gezeigt werden, welche durch den NMDA-Rezeptorblocker MK801 unterbunden wurden. Darüber hinaus wurden Änderungen im Expressionslevel von einigen bestimmten Proteinen, welche von Proben aus den TEER-Versuchen gewonnen wurden, mit Hilfe von Western Blots gezeigt.
Zusammenfassend bestätigten die gewonnen Resultate einerseits jenen Daten der Literatur, jedoch auch eine mögliche Beteiligung zusätzlicher Targets für NMDA-Modulatoren wie NMDA und MK801 als den NMDA-Rezeptor wäre andererseits möglich. In Bezug zu den Methoden konnte ein 96-Well Plattenfluoreszenz-Assay etabliert werden, welcher eventuell als erste Vorscreening-Methode zur Findung mögliche Substrate, welche gegen die Blut-Hirn-Schranke gerichtet sind und den intrazellulären Ca2+-Spiegel regulieren, verwendet werden kann. Anschließend können Methoden wie Western Blots und TEER-Messungen angewendet werden, um die funktionelle Bedeutung dieser intrazellulären kalziummodulierden Substanzen zu überprüfen.
Abstract
(Englisch)
A diversity of disease processes and conditions such as Alzheimer´s disease, schizophrenia, epilepsy and stroke are major pathological conditions at present time. Although such sufferings are caused by different mechanisms they share the NMDA-receptor as one common target. The number of reports suggesting the presence of this glutamate-gated ion-channel at the blood-brain barrier and its participation in major regulatory mechanisms increased in the last years.
The first goal of this thesis was to confirm and investigate the presence of NMDAR-subunits NR-1, -2A, -2B, and -2C in human blood-brain barrier cell line ECV304 by western blot analysis and immunofluorescence microscopy in order to obtain an overview of possible compositions of a functional NMDA-receptor. Subsequently, it was aimed at establishing a 96-well plate fluorescence-assay for measuring the intracellular Ca2+-level as a functional parameter of the activation of the NMDA-receptor. Furthermore, methods as the measurement of the transendothelial electrical resistance (TEER) and western blotting were to be performed in order to investigate the influence of overstimulation or inhibition of the NMDA-receptors on specific blood-brain barrier properties. The presence of all four investigated NMDA-receptor subunits in the used blood-brain barrier in vitro model was shown, but their localisation within the cell membrane was not proven which is suggested to be prerequisite for NMDAR-functionality as a Ca2+-channel. In concordance to this, Ca2+-level measurements revealed controversial results with NMDAR-agonists. For further validation of the test system, other intracellular Ca2+-level modulators were additionally tested which confirmed the suitability of the test set-up. Despite of this, adverse effects of glutamate onto blood-brain barrier integrity (TEER) were confirmed which were inhibited by NMDAR-blocker MK801. Moreover, changes in the expression levels of several specific proteins of samples obtained from the TEER experiments were shown by western blotting.
Taken together, obtained data confirmed data from the literature on the one hand, but also suggested possible involvement of additional targets for NMDA-modulators NMDA and MK801 than the NMDAR on the other hand. With regard to the methods, a 96-well plate fluorescence assay was established which may be used as a first screening method to find possible substrates targeting the blood-brain barrier and regulating the intracellular Ca2+-level. In the next step, methods as western blotting and TEER measurement could be applied in order to prove the functional relevance of these intracellular calcium modulating drug.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
blood-brain barrier BBB in vitro studies ECV304 cell line NMDA-receptor NMDAR ionotropic glutamate-receptor
Schlagwörter
(Deutsch)
Blut-Hirn-Schranke BHS in vitro Studien ECV304-Zelllinie NMDA-Rezeptor NMDAR ionotroper Glutamatrezeptor
Autor*innen
Michael Freidl
Haupttitel (Englisch)
NMDA-receptor functionality at the blood-brain barrier in vitro
Paralleltitel (Deutsch)
NMDA-Rezeptorfunktionalität bei der Blut-Hirn-Schranke in vitro
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
XV, 129 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Noe
AC Nummer
AC08450533
Utheses ID
11778
Studienkennzahl
UA | 449 | | |