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Biocidal activity and biochemistry of Leptodactylus pentadactylus frog foam nests – an analysis with insights into N-glycosylation
Sylvia Tippl
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Julia Walochnik
DOI
10.25365/thesis.13125
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30479.53510.376070-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Bildung von Schaumnestern während der Paarungszeit ist eine von zahlreichen Strategien, die von tropischen Fröschen zum Schutz der Nachkommenschaft vor schädlichen Umwelteinflüssen genutzt werden. Leptodactylus pentadactylus – der Südamerikanische Ochsenfrosch, welcher in Mittel- und Südamerika beheimatet ist – legt die befruchteten Eier in Schaumnester ab, die bis zum Schlüpfen der Kaulquappen in tropischen Gewässern liegen, ohne von Pilzen oder anderen Pathogenen überwuchert zu werden.
In vorliegender Arbeit sollten zunächst die chemischen Eigenschaften des Schaummaterials untersucht werden. Eines der primären Ziele bestand darin, einen Eindruck von den spezifischen Glykanstrukturen der Glykoproteine der Nester von L. pentadactylus zu gewinnen, wobei vor allem auf die Charakterisierung der N-Glykane Wert gelegt wurde. Zusätzlich war die Untersuchung der potentiellen bioziden Aktivität des Schaumes ein wichtiges Ziel dieser Studie. Darüber hinaus, sollten außerdem die Mikroorganismen, welche mit dem Schaum assoziiert sind sowie deren mögliche schützende Funktion im Schaum, untersucht werden.
Die Analyse der Glykane erfolgte mit Hilfe von Lektin-blots und Detektion mittels alkalischer Phosphatase. Weiters wurde eine Glykanpräparation mit anschließender MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight) Massenspektrometrie-Analyse durchgeführt. Zur Untersuchung der bioziden Wirkung des Schaumes wurden Versuche an Trypanosoma cruzi, Leishmania infantum, L. donovani und Acanthamoeba in Mikrotiterplatten durchgeführt, in denen die Parasiten mit dem homogenisierten und filtrierten Schaum (in verschiedenen Konzentrationen) behandelt wurden. Die Wirkung des Schaumes gegen die Bakterien Enterococcus hirae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Mycobacterium avium, M. terrae und Staphylococcus aureus, wie auch gegen die Pilze Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae und Trichophyton mentagrophytes erfolgte in Kulturplatten, auf die das Schaumextrakt aufgetropft wurde.
Zur Isolation von Bakterien aus dem Inneren des Nestes, wurden kleine Stücke des Schaumes in Flüssigmedium inokuliert. Sämtliche isolierte Stämme wurden auf in vitro Antagonismus gegen C. albicans, und jene die biozide Effekte zeigten auch zusätzlich gegen Mycobacterium avium, M. terrae und Trichophyton mentagrophytes getested. Die Bakterien wurden schließlich über ihre enzymatischen Aktivitäten und mittels Massenspektrometrie identifiziert.
Insgesamt konnten etwa 60 N-Glykane strukturell differenziert werden. Darüber hinaus konnte das Vorliegen von hybriden und komplexen N-Glykanen sowie das Vorhandensein weiterer Glykane, vermutlich O-Glykane, in den Glykoproteinen des Schaumnestes nachgewiesen werden.
Weiters konnte auch die antimikrobielle Wirksamkeit des Schaumnestes gezeigt werden. Für L. infantum und L. donovani zeigte sich durch die Behandlung mit dem Schaum eine deutliche Wachstumshemmung. T. cruzi und Acanthamoeba hingegen zeigten keine Reaktion. Die meisten Bakterien und Pilzen wurden durch die Substanz nicht inhibiert, jedoch konnte eine schwache Wachstumshemmung bei M. avium und M. terrae beobachtet werden.
Von den 25 Bakterienstämmen, die insgesamt aus dem Nest isoliert werden konnten, zeigten drei biozide Effekte auf Candida albicans. Diese Bakterien wurden mit großer Verlässlichkeit als Vertreter der Arten Ralstonia pickettii und Pseudomonas fluorescens identifiziert. Ein P. fluorescens-Stamm zeigte eine zusätzliche biozide Aktivität gegen
M. avium, der andere gegen T. mentagrophytes.
Die vorliegende Arbeit konnte zum ersten Mal die Anwesenheit von N-Glykanen im Schaummaterial von Fröschen zeigen und stellt einen allgemeinen Beitrag zur Kenntnis der N-Glykane bei Amphibien dar. Der Schwerpunkt bisheriger Studien lag vor allem bei der Untersuchung von O-Glykanen. Auch die Biozidität der Schaumnester wurde schon seit Langem diskutiert, konnte jedoch in der vorliegenden Studie zum ersten Mal tatsächlich nachgewiesen werden, auch wenn das Wachstum von Bakterien offenbar nicht vollständig gehemmt wird. Tatsächlich wird der Schaum sogar von einer Reihe von Bakterien bevölkert, von denen einige wachstumshemmend bei bestimmten anderen Mikroorganismen wirken. P. fluorescens ist für seine antimikrobiellen Aktivitäten bekannt, die Art konnte jedoch zum ersten Mal im Froschschaum von L. pentadactylus detektiert werden. Ein möglicher Zusammenhang zwischen der Biozidität des Nestes und den antagonistischen Mikroorganismen wird vermutet.
Abstract
(Englisch)
Foam nesting is one of the numerous strategies evolved in tropical frogs to protect their eggs and developing tadpoles against environmental challenge. Leptodactylus pentadactylus – the smoky jungle frog of Central and South America – produces voluminous foam nests containing fertilized eggs, lying in the jungle for several days without degradation by fungi or other pathogens. However, the mechanisms ensuring long-term stability of the nests and protection of the brood are not completely understood and suggestions are contradictory.
In the first line, it was aimed to clarify the chemical properties of the foam nest material and to get an impression of the specific glycan structures, especially of the N-glycans of the glycoproteins of the foam nest of L. pentadactylus. Another prior intention of the present study was the analysis of a potential biocidal activity of the frog foam nest. Finally, it was aimed to unravel the microbial community that is associated with the nest and its potential protective function.
The glycans were analysed by lectin blots followed by analysis with alkaline phosphatase, and by glycan preparation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) analysis.
For testing the biocidal potential of the foam Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani,
L. infantum and Acanthamoeba were investigated for their susceptibility to the homogenized and filtered foam extract in different concentrations in microtiter plates. Moreover, the bacteria Enterococcus hirae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Mycobacterium avium, M. terrae and Staphylococcus aureus, as well as the fungi Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae and Trichophyton mentagrophytes were investigated for their susceptibility in agar-plate diffusion assays with foam material.
Moreover, bacteria were isolated from the inside of the nest by inoculation of small volumes of foam pieces into liquid medium. Several isolated bacterial strains were tested for in vitro antagonism towards C. albicans, and those showing biocidal effects, were tested additionally against Mycobacterium avium, M. terrae and Trichophyton mentagrophytes. The bacteria were finally classified via their enzymatic activities and by mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).
In total, approximately 60 N-glycan species could be structurally differentiated. The presence of both, hybrid- and complex-type N-glycan structures was indicated, as well as the presence of other glycans (putatively O-glycans) within the foam nest glycoproteins.
Moreover, biocidity of the foam nest was revealed. Treatment of L. infantum and L. donovani with the foam resulted in growth inhibition. T. cruzi and Acanthamoeba were not susceptible to the foam material. Furthermore, there was no microbicidal activity on most bacteria and fungi; weak growth inhibition was observed for M. avium and M. terrae.
Finally, 25 different bacterial strains were isolated from the inside of the nest, three of which also showed biocidal effects on Candida albicans. These bacteria were classified with high reliability as strains of Ralstonia pickettii and (in two cases) Pseudomonas fluorescens. One P. fluorescens strain additionally showed a biocidal effect on M. avium and the other one on T. mentagrophytes.
The presence of N-glycans in the foam material of L. pentadacytlus was shown for the first time and is a general contribution to the knowledge of N-glycans in the amphibian world, as until now in particular O-glycans of amphibians have been studied. Moreover, antimicrobial activities of foam nests have long been assumed, however, could here be shown for the first time, although the nests do not seem to totally inhibit bacterial growth. In fact, they harbour different kinds of bacterial species, some of which themselves cause growth inhibition of other microorganisms. P. fluorescens is known to show antimicrobial activities, however, in the current study it was detected in the foam nests of
L. pentadactylus for the first time. A possible connection between the biocidity of the nest and the antagonistic microorganisms in the nests is suggested.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Biocidal activity frog Leptodactylus pentadactylus biochemistry glycosylation
Schlagwörter
(Deutsch)
Biozide Aktivität Frosch Leptodactylus pentadactylus Biochemie Glykosylierung
Autor*innen
Sylvia Tippl
Haupttitel (Englisch)
Biocidal activity and biochemistry of Leptodactylus pentadactylus frog foam nests – an analysis with insights into N-glycosylation
Paralleltitel (Deutsch)
Biozide Aktivität und Biochemie von Leptodactylus pentadactylus Frosch-Schaumnestern - ein Analyse mit Einblicken in die N-Glykosylierung
Paralleltitel (Englisch)
Biocidal activity and biochemistry of Leptodactylus pentadactylus frog foam nests – an analysis with insights into N-glycosylation
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
122 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Julia Walochnik
AC Nummer
AC08784662
Utheses ID
11804
Studienkennzahl
UA | 441 | | |