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mTor signalling in primary human lung fibroblasts in 3D cultures
Nina Kramer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Helmut Dolznig
DOI
10.25365/thesis.13185
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-16428.12146.921722-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
3D-Zellkultur wird verwendet, um eine gewebeähnliche Umgebung, wie sie in-vivo zu finden ist, nachzuahmen. Ein weiterer Verwendungszweck ist die Untersuchung von molekularen und biochemischen Aspekten vieler physiologischer Funktionen unter in-vitro Bedingungen. Der „mammalian target of rapamycin (mTOR)-pathway” ist ein wichtiger Signalweg der Zellen, der essentielle Funktionen wie ribosomale Biosynthese, Zellteilung, Stoffwechsel und Zellgröße kontrolliert. Dieser wurde bisher ausführlich in Monolayerkulturen untersucht, jedoch nicht in Zellen in 3D Kultur. Da die Form und die Umgebung der Zellen ihr Verhalten und ihre Genexpression bestimmen können, wollten wir Unterschiede zwischen Fibroblasten aus 2D- und 3D-Kultur, in Bezug auf den mTOR-Signalweg, identifizieren. Weiters waren wir an ihrem Invasionspotenzial innerhalb der Kollagen-Gele interessiert. Nachdem wir die Kulturbedingungen für IMR-90 Fibroblasten in Kollagen-Gelen und ein Isolations-Protokoll etablierten, wurde der DNA-Gehalt und die Zellgröße von Zellen aus 2D- und 3D-Kultur mit Hilfe von FACS-Analyse bestimmt. „Spheroid invasion assays“ wurden unter Anwesenheit des spezifischen mTOR Inhibitors Rapamycin und siRNA vermittelter knock-downs von Raptor und Rictor, den Komponenten zweier unterschiedlicher mTOR Multiproteinkomplexe, durchgeführt. Immunfluoreszenz-Analysen wurden mit Antikörpern gegen mTOR Komponenten, phospho Histone H3 und cleaved caspase-3 durchgeführt. Im Unterschied zu 2D fanden wir in Fibroblasten aus 3D- Kultur eine massive Reduktion der Zellgröße, geringere Zellteilung und Veränderungen in der Granularität. Veränderte Zellgröße und Zellzyklusverteilung weisen auf Änderungen des mTOR-Signalweges hin, Immunfluoreszenzanalysen zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Menge oder der Aktivität der beteiligten Proteine. Einige Komponenten des mTOR-Signalweges waren in Bezug auf ihre Lokalisation in den Fibroblasten verändert, z. B. pAKT (S473), welches eine vesikulärere Verteilung zeigte und das Totalprotein AKT, das innerhalb der Kerne in 3D Kultur hochreguliert war. Weiters zeigten in Kollagen-Gelen kultivierte Zellen reduzierte Invasion nach Behandlung mit Rapamycin und Transfektion mit Raptor und Rictor siRNA. Die invasiven Eigenschaften von IMR-90 Zellen wurden nach Behandlung mit Rictor siRNA hochgradig reduziert, während die Transfektion mit Raptor siRNA eine mittelgradige Wirkung zeigte. Immunfluoreszenz-Analyse zeigte eine Induktion von Apoptose in Rapamycin behandelten Sphäroiden durch einen erhöhten Anteil von früh (cleaved capase-3+) und spät apoptotischen (cleaved caspase-3+/kondensierten Kernen+) Fibroblasten. Zusammenfassend stellten wir Veränderungen in Fibroblasten aus 3D-Kultur verglichen mit 2D-Kultur fest. Weiters fanden wir Einflüsse des mTOR-Signalweges auf die invasiven Eigenschaften von IMR-90 Fibroblasten, allerdings werden noch weitere quantitative Auswertungen des mTOR-Signalweges (zB durch Western-Blot-Analyse) benötigt, um die molekularen Mechanismus, die zu reduzierter Zellgröße und Zellzyklus Verteilung, sowie zu einem Rückgang der invasiven Kapazität durch mTOR-Hemmung führen, zu bestimmen.
Abstract
(Englisch)
3D cell culture is supposed to mimick a tissue-like environment found in-vivo and it is used to study molecular and biochemical aspects of many physiologic functions under in-vitro conditions. A key regulatory pathway of important cellular functions such as ribosomal biosynthesis, proliferation, metabolism and cell size is the mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway. It was previously extensively studied using monolayer culture, however mTOR signalling has not been studied very well in cells cultivated in 3D. Since the environment and the shape of cells can determine its behaviour and gene expression, we wanted to identify differences between 2D and 3D culture in respect to mTOR signalling. Furthermore we were interested in the invasion potential of fibroblasts in collagen gels under these experimental settings. After establishing culture conditions for IMR-90 lung fibroblasts in collagen gels and a harvesting protocol, cells from 2D and 3D culture were subjected to FACS analysis and DNA content and cell size was determined. Spheroid invasion assays were performed in the presence of the specific mTOR inhibitor rapamycin and siRNA mediated knockdowns of raptor- and rictor, two components of different mTOR multiprotein complexes. Immunofluorescence analyses were done with antibodies for mTOR pathway components, α-phospho Histone H3 and α-cleaved caspase-3. We found a massive cell size reduction, less proliferation and changes in the granularity in fibroblasts cultivated in 3D as compared to cells in 2D. Altered cell size and cell cycle distribution indicate changes in the mTOR pathway, however immunofluorescence analyses did not show significant differences in the amount or activity of the proteins. Some mTOR pathway components were altered in respect to localisation, e.g. pAKT (S473) displayed a more vesicular like distribution and total AKT protein was upregulated within the nuclei in fibroblasts cultivated in 3D. Furthermore cells cultured in collagen gels displayed reduced invasion after treatment with rapamycin and transfection with raptor and rictor siRNA. The invasive properties of the IMR-90 cells were profoundly reduced upon rictor knockdown, whereas raptor knockdown displayed an intermediate effect. Immunofluorescence analysis showed induction of apoptosis in rapamycin treated spheroids as demonstrated by an increase in the proportion of early apoptotic (cleaved capase-3+) and late apoptotic (cleaved caspase+/condensed nuclei+) fibroblasts.
In summary we found profound alterations in fibroblasts cultivated in 3D as compared to 2D and an influence of mTOR signalling in the invasive properties of IMR-90 fibroblasts, however, further quantitative evaluation of the mTOR pathway (e.g. by Western blot analysis) is needed to determine the molecular events leading to reduced cell cycle progression and size as well as to a decrease in invasive capacity upon mTOR inhibition.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
mTOR 3D cell culture collagen gel fibroblasts rapamycin invasion
Schlagwörter
(Deutsch)
mTOR 3D-Zellkultur Kollagen-Gele Fibroblasten Rapamycin Invasion
Autor*innen
Nina Kramer
Haupttitel (Englisch)
mTor signalling in primary human lung fibroblasts in 3D cultures
Paralleltitel (Deutsch)
mTOR Signaltransduktion in primären humanen Lungenfibroblasten in 3D Kultur
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
119 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Helmut Dolznig
AC Nummer
AC08451322
Utheses ID
11855
Studienkennzahl
UA | 442 | | |