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Finding RNA targets for the multidomain cyclophilin AtCyp59 by Genomic SELEX in Arabidopsis thaliana
Olga Bannikova
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Andrea Barta
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29815.11966.891065-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Cyclophiline gehören zu den weitverbreitesten Proteinen in Archeen, Bakterien und Eukarionten und bilden auch die größte beschriebene Proteinfamilie der Spezies A. thaliana. Die Cyclophiline weisen eine peptidyl–prolyl cis–trans Isomerase (PPIase) Aktivität auf und katalysieren die cis–trans Isomerisierung der Prolin vorangehender Peptid-Bindungen. Die Mehrheit der Cyclophiline (PPIasen) ist eher klein, sie beinhalten lediglich eine einzige PPIase Domäne bestehend aus 120 Aminosäuren. Dennoch sind wenige Cyclophilin Proteine mit Mehrfachdomänen bekannt. Zu den höchst komplexen Cyclophilin Vertretern, gehört die A. thaliana Cyp59 (AtCyp59). Das Protein hat eine, in der Evolution von Hefe zu Menschen konservierte, besondere Domänen-Organisation. Diese besteht aus einer N-Terminal PPIase gefolgt von einem RNA-Erkennungs-Motiv (RNA recognition motif, RRM) und der C-Terminus Domäne, welche wiederum geladene Aminosäuren wie auch Serinen oder RS/RD Dipeptid Wiederholungen beinhaltet. Aufgrund ihrer multidomän Struktur könnte AtCyp59 in vielen zellulären Prozessen, wie beispielsweise Splicing, RNA-processing, Proteintransport und Zellreifung etc., involviert sein. Darüberhinaus wurde bereits gezeigt dass AtCyp59 Proteine sich im Nukleus aufhalten und dort mit der C-Terminus Domäne von RNA Polymerase II interagieren. Die SR/RD Domäne hingegen wird zur Bindung an SR Proteine verwendet. Die exakte biologische Funktion des RRM Motives ist immer noch unklar. In dieser Arbeit präsentiere ich ein genomisches SELEX, eine genomweite analyse Methode, die eine Suche des RNA-bindenden Motivs der RRM Domäne von AtCyp59 ermöglicht. Mit Hilfe von random priming haben wir eine genomische Bibliothek von A. thaliana, bestehend aus 50-300nt langen überlappenden Sequenzen, erstellt. In Verbindung mit dem SELEX Verfahren waren wir im Stande eine 7nt lange RNA-bindende Konsensusequenz zu identifizieren, die eine spezifische Bindung an die AtCyp59 und dessen RRM Domäne in vitro und in vivo aufweist. Mutationen an der RRM Domäne so wie auch der Konsensusequenz verhinderten eine Bildung des RNA- Protein Komplexes. Erweiterte bioinformatischen Analysen zeigten, dass dieses Bindung –Motiv ein globales Sequenzmerkmal repräsentiert, welches sich in der Nähe des transnationalen stop-codon bei 70% aller A. thaliana mRNAs befindet. Untersuchungen der Bindungsaktivität zwischen RNA und der AtCyp59 der RRM Domäne wiesen eine Beteiligung der PPIase und RS/RD- Reichen Domäne in die Bindung an die strukturierte RNA. Die präsentierten Daten erlauben uns einen Einblick in die Funktion der RRM Domäne von AtCyp59, eines regulatorischen Proteins welches zwischen 2 wichtigen zellulären Prozessen; Transkription und Splicing steht, zu gewähren.
Abstract
(Englisch)
Cyclophilins are ubiquitous proteins found in archea, bacteria, and eukarya, with the largest family described so far in the plant species A. thaliana.
Cyclophilins possess peptidyl–prolyl cis–trans isomerase (PPIase) activity, they catalyze cis–trans isomerization of peptide bonds preceding proline. The majority of cyclophilins (PPIases) are small proteins containing only a PPIase domain of about 120 amino acids. However, several multidomain cyclophilins from different organisms have been also described. Among them, the most complex multidomain cyclophilin characterized so far is A. thaliana Cyp59 (AtCyp59). It has a unique, conserved from yeast to human, domain organization, consisting of N-terminal PPIase domain followed by an RNA recognition motif (RRM) and a C-terminal domain enriched in charged amino acids and serines or RS/RD dipeptide repeats. As a consequence of its multidomain organization, AtCyp59 may be involved in several cellular processes such as splicing, RNA processing, protein trafficking and maturation, etc. AtCyp59 has been shown to localize in the nucleus where it interacts with the C-terminal domain of RNA Polymerase II. Via SR/RD domain it interacts with SR proteins. Up-to-date, the exact biological functions of RRM domain are still remaining unclear. Here we present genomic SELEX, the genome-wide screen method allowing us to search for RNA targets of RRM domain of AtCyp59. By random priming we constructed the representative genomic library of A. thaliana, consisting of 50-300nt long overlapping sequences. The library was accordingly used for genomic SELEX, allowing identification of the 7nt-long RNA binding consensus which was shown to bind to RRM domain of AtCyp59 in a sequence specific manner in vitro and in vivo. Mutations in either RRM domain or consensus sequence prevented formation of RNA-protein complex. Bioinformatics analysis has shown that this binding motif represents a global signature located near the translational stop-codon in 70% of A. thaliana mRNAs. Comparative analysis of RNA-binding activity AtCyp59 and its RRM domain indicated contribution of PPIase and RS/RD-rich domains to binding to structured RNAs. Presented data allowed us to shed a light on function of RRM domain of AtCyp59, global regulator protein lying on interconnection between two important cellular processes, transcription and splicing.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Genomic DNA and RNA libraries protein binding motif affinity selection atCyp59 transcription splicing
Schlagwörter
(Deutsch)
Genomischen DNA und RNA Bibliothek/ RNA-bindende Konsensusequenz AtCyp59 RNA Transkription und Splicing
Autor*innen
Olga Bannikova
Haupttitel (Englisch)
Finding RNA targets for the multidomain cyclophilin AtCyp59 by Genomic SELEX in Arabidopsis thaliana
Paralleltitel (Deutsch)
Suche mit Genomischen SELEX nach RNA - Bindungmotiven des Mehrfachdomänen Proteins AtCyp59 in Arabidopsis thaliana
Paralleltitel (Englisch)
Finding RNA targets for the multidomain cyclophilin AtCyp59 by Genomic SELEX in Arabidopsis thaliana
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
161 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Renee Schroeder ,
Norbert Polacek
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC08877205
Utheses ID
11998
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |