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Inhibition of ribonucleotide reductase by small molecules

a key antitumor mechanism in human cancer cells

Geraldine Graser

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Thomas Szekeres

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DOI

10.25365/thesis.13356

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29846.27317.441761-4

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Ribonukleotid Reduktase (RR) ist ein Enzym, das für die Konvertierung von Ribonukleotiddiphosphaten in Desoxyribonukleotiddiposphate essentiell ist. Diese Bausteine bilden die Grundlage für DNA Synthese und DNA Reparatur. Die de novo dNTP Synthese stellt eine exakt regulierte Reaktion dar, weshalb RR hier als limitierendes Enzym fungiert. Zahlreiche Untersuchungen ergaben, dass die Expression von RR in Tumorzellen hochreguliert wird, wodurch dieses Enzym für zytotoxische chemotherapeutische Substanzen ein sensibles Ziel darstellt. Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden zwei neue Substanzen untersucht, von welchen man sich in verschiedenen humanen Tumorzelllinien antikanzerogene Wirkung erhoffte. ABNM-13 ist ein neu synthetisiertes N-hydroxy-N`-aminoguanidin welches mittels 3D molecular space modeling Technikenentworfen wurde, um gezielt die RR Aktivität zu hemmen. Digalloylresveratrol (DIG) hingegen ist ein synthetisch hergestellter Ester, zusammengesetzt aus den natürlich vorkommenden polyhydroxyphenolischen Substanzen Resveratrol (3,4,5-trihydroxystilbene; RV) und Gallussäure (3,4,5-trihydroxybenzoic acid; GA). Jede der beiden Einzelkomponenten zeigte bereits in früheren Untersuchungen vielversprechende Ergebnisse in der Krebsbehandlung. Die biochemische Wirkung von ABNM-13 wurde in humanen HL-60 Promyelozyten-Leukämiezellen untersucht, wohingegen die Effekte von DIG in verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien (AsPC-1, BxPC-3, PANC-1) nachgewiesen werden sollten. Durch einen möglichen inhibierenden Effekt beider Substanzen auf die Aktivität der RR wäre eine Störung des Zellstoffwechsels die Folge, die in einer Hemmung der DNA Replikation, einem Arrest des Zellwachstums und möglicherweise Induktion von Apoptose resultiert. Sowohl ABNM-13 als auch DIG bewirkten aufgrund erster Untersuchungen tatsächlich eine signifikante Hemmung der RR Aktivität, was durch die Abnahme des Einbaus von 14C-markiertem Cytidin in die DNA von Tumorzellen gezeigt werden konnte. Des Weiteren konnte demonstriert werden, dass die ausgewogene Verteilung der dNTP Pools durch die Behandlung mit ABNM-13 und DIG verändert wird. Beide Substanzen greifen in die Regulation des Zellzyklus ein, was schließlich zur Aktivierung der spezifischen Checkpoint Effektorkinasen Chk1 und Chk2 führt. Durch die Hemmung der RR Aktivität wird Chk1 und/oder Chk2 aktiviert, was wiederum den Abbau von Cdc25A bewirkt. Cdc25A ist ein Onkogen, das beim Zellzyklus-Transit von entscheidender Bedeutung ist. Die Behandlung von HL-60 Zellen mit ABNM-13 bewirkt zusätzlich eine Erhöhung des Cdc25B Proteinlevels, was Dephosphorylierung und Aktivierung von Chk1 zur Folge hat. Durch diese Dysregulation von Cdc25A und Cdc25B kann in HL-60 Zellen in weiterer Folge ein S-Phase Arrest beobachtet werden. Western Blot Analysen nach Behandlung in AsPC-1 Zellen mit DIG zeigten, dass eine Hemmung der RR Aktivität die Erhöhung des Expressionslevels von mitogen-aktiverenden Proteinkinasen p38 und Akt bewirkt. Im Gegensatz dazu wurde allerdings auch eine Hemmung des zytoplasmatischen Erk1/2 Signalweges beobachtet. Interessanterweise induzieren beide Substanzen nur in sehr geringem Maße Apoptose. Das legt den Schluss nahe, dass sowohl ABNM-13 als auch DIG eher hemmend auf den Zellzyklus als induzierend auf den programmierten Zelltod wirken. Schließlich wurde gezeigt, dass ABNM-13 in Kombination mit Cytarabine (Ara-C), einem bewährten „first-line“ Zytostatikum, zu einer signifikanten Verstärkung des antineoplastischen Effekts von Ara-C führt. Im Gegensatz dazu konnte DIG in Kombination mit Gemcitabine (dFdC) keinen ähnlichen Effekt erzielen. Aufgrund dieser vielversprechenden Ergebnisse und Erkenntnisse könnten ABNM-13 und DIG zu potentiellen Anwärtern für etwaige präklinische Untersuchungen oder in vivo Studien werden.

Abstract

(Englisch)

The enzyme ribonucleotide reductase (RR) is essential for the conversion of ribonucleoside diphosphates into deoxyribonucleoside diphosphates, which are the basic units for DNA synthesis and DNA repair. De novo dNTP synthesis is an exactly regulated reaction, thus making RR the rate-limiting enzyme. Because of its up-regulation in malignant tumor cells, RR is considered to be a sensitive target for cytotoxic chemotherapeutic agents. In this diploma thesis, two different novel compounds were investigated for their anticancer activity in various human tumor cell lines. ABNM-13 is a novel designed N-hydroxy-N`-aminoguanidine using 3D molecular space modeling techniques while Digalloylresveratrol (DIG) represents a novel synthetic ester of the polyhydroxy phenolic substances resveratrol (3,4,5-trihydroxystilbene; RV) and gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid; GA). Both components of DIG are naturally occurring substances with promising results in cancer treatment. Biochemical effects of ABNM-13 were investigated in human HL-60 promyelocytic leukemia cells whereas effects of DIG were evaluated in three different pancreatic cancer cell lines (AsPC-1, BxPC-3, and PANC-1). ABNM-13 as well as DIG were suggested to inhibit RR activity causing block of DNA replication, cell perturbations, induction of programmed cell death, and growth arrest. Indeed, both novel agents proved to be effective inhibitors of RR by significantly lowering the incorporation of 14C-labeled cytidine into DNA of tumor cells. Furthermore, both compounds caused alterations of dNTP pool balance and provoked cell cycle arrest and activation of cell cycle checkpoint effector kinases Chk1 and Chk2. Inhibition of RR activity results in activation of Chk1 and/or Chk2, leading to degradation of Cdc25A, which is responsible for cell cycle transit. ABNM-13 treatment of HL-60 cells further led to up-regulation of Cdc25B, which caused dephosphorylation and activation of Chk1. Dysregulation of both Cdc25A and Cdc25B induced cell cycle arrest in S-phase. Western blot analysis after treatment of AsPC-1 cells with DIG demonstrated that inhibition of RR activity causes replicative stress, which results in up-regulation of mitogen-activated protein kinases p38 and Akt. Interestingly, an inhibition of Erk1/2 cytoplasmic pathway could also be observed. Our investigations also showed that the primary antineoplastic effect of DIG as well as ABNM-13 is rather inhibition of the cell cycle than induction of programmed cell death. ABNM-13 was then combined with Cytarabine (Ara-C), a first-line cytotoxic agent resulting in a synergistic potentiation of the antineoplastic effect of Ara-C. In contrast, DIG in combination with Gemcitabine (dFdC) did not show any synergistic effects. Due to these promising results, ABNM-13 and DIG may be potential candidates for further preclinical investigations and in vivo studies.

Autor*innen

Geraldine Graser

Haupttitel (Englisch)

Inhibition of ribonucleotide reductase by small molecules

Hauptuntertitel (Englisch)

a key antitumor mechanism in human cancer cells

Paralleltitel (Deutsch)

Hemmung der Ribonukleotid Reduktase durch "small molecules": Ein entscheidender Wirkmechanismus in humanen Tumorzelllinien

Paralleltitel (Englisch)

Inhibition of ribonucleotide reductase by small molecules : a key antitumor mechanism in human cancer cells

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

83 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Thomas Szekeres

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC08797391

Utheses ID

12004

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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Schlagwörter