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Peroxisome proliferation in the yeast saccharomyces cerevisiae and functional analysis of the membrane protein Pex30p
Thomas Heil
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Cecile Brocard
DOI
10.25365/thesis.13357
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30324.79209.783954-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Peroxisomen sind von einer Membran umgebene Organ
ellen und kommen in allen eukaryotischen Zellen vor. Zu ihren Hauptaufgaben gehören der Lipidmetabolismus und die Entgiftung der Zelle über Abbau von reaktiven Sauerstoffspezies. Defekte in der Peroxisombiogenese oder –funktion führen bei Menschen zu tödlichen Krankheiten wie das Zellweger-Syndrom. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae stellt einen exzellenten Modellorganismus für die Untersuchung von Peroxisomdynamik dar, da sie die β-Oxidation von Fettsäuren ausschließlich in Peroxisomen stattfindet. Deswegen sind Peroxisomen beim zellulären Wachstum durch Respiration auf Fettsäure-haltigen Medien essentiell, während Peroxisomen beim Fermentieren auf Glucosemedien entbehrlich sind. Peroxisomen sind sehr vielseitige Organellen, da sie ihre Anzahl,
Größe, Form und Proteingehalt sehr schnell an Umweltbedi
ngungen anpassen können. Bis heute sind 31 Proteine, sogenannte Peroxine, entdeckt worden, die in der Biogenese von Peroxisomen involviert sind. Pex30p ist ein Schlüsselprotein bei der Regulation von Anzahl und Größe von Peroxisomen. Hefe Zellen, deren PEX30-Gen deletiert wurde, besitzen eine größere Anzahl an Peroxisomen im Vergleich zum Wildtyp.
In vorangegangen Studien mit Pex30p-beinhaltenden Proteinkomplexen, konnten einige Peroxine und ER-Proteine identifiziert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse verwendeten wir eine neue, auf Methylierung basierende, Untersuchungsmethode, um direkte Interaktionspartner von Pex30p zu identifizieren.
In dieser Untersuchungsmethode wird ein Histon-Tag von einer Histonmethyltransferase permanent methyliert, wenn zwei Proteine miteinander interagieren. Diese Methylierung ist im Anschluss in einem Western-Blot mit Hilfe von spezifischen Antikörpern visualisierbar. Zu den Stärken dieser Untersuchungsmethode zählen, dass sie transiente Interaktionen von Membranproteinen detektieren kann. Zusätzlich analysierten wir mittels Fluoreszenzmikroskopie die Lokalisierung von Pex30p, welches mit GFP fusioniert wurde. Außerdem deletierten wir ein Paar putativer Transmembran¬domänen in der Pex30p-Sequenz und untersuchten den daraus resultierenden Effekt auf die Lokalisierung, Interaktionen und Häufigkeit der Peroxisomen. Für letzteres führten wir eine statistische Analyse über die Anzahl an Peroxisomen per Zelle durch.
Zusammengefasst konnten wir zeigen, dass Pex30p in deutlich ausgeprägten Punkten im ER akkumuliert. Peroxisomen binden an diese von Pex30p gebildeten Akkumulationen und verlink
en damit Peroxisomen mit dem ER. Diese Bindung ist beim Wachstum Ölsäure, das zu einer Induktion von Peroxisomprolif
eration führt, besonders stark ausgeprägt. Diese Beobachtung führt zu der Annahme, dass Pex30p eine Rolle beim Verbinden von Peroxisomen mit dem ER spielt. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Deletion einer Transmembranregion in der Pex30p-Sequenz einen Effekt auf die Lokalisierung und die Interaktionsfähigkeit mit Rtn1p und Pex11p haben und dass Pex30pΔTMD-exprimierende Zellen eine deutlich erhöhte Anzahl an Peroxisomen besitzen. Unsere Ergebnisse führten zu der Erstellung eines Modells für die Peroxisombiogenese, in der dieses Organell von Pex30p-beinhaltenden Komplexen an die ER-Membran gebunden wird.
Abstract
(Englisch)
Peroxisomes are single membrane-bound organelles and are present in every eukaryotic cell. They are mainly involved in lipid metabolism and detoxification of reactive oxygen species. In humans, defects in peroxisome biogenesis or function lead to lethal diseases such as the Zellweger syndrome. The yeast Saccharomyces cerevisiae represents an excellent model to study peroxisome dynamics because in this species β-oxidation of fatty acids occurs exclusively in peroxisomes, making these organelles essential for a cellular growth by respiration on fatty acid-containing medium as opposed to fermentation on glucose medium for which peroxisomes are dispensable. Peroxisomes are versatile organelles and they can rapidly adjust their number, size, shape, and protein content depending on the environmental conditions. To date, 31 proteins involved in peroxisome biogenesis, the peroxins, have been identified. Pex30p is a key-player in the regulation of peroxisome size and number. Yeast cells deleted for PEX30 exhibit more peroxisome than wild-type cells.
In previous studies on Pex30p-containing protein complexes we identified several peroxins as well as ER-resident proteins. Based on these results, we sought to characterize the direct interaction partners of Pex30p using a novel methylation-based assay. In this assay, a permanent methylation of a histone tag is developed by a histone methyl transferase upon interaction of the two proteins tested that can later on be visualized by western blot analysis using specific antibodies. An asset of this assay relies in the ability to detect transient interaction of membrane proteins. One task of this thesis was to adapt the existing protocol to the study of peroxisomal proteins. Additionally, we scrutinized the localization of GFP-tagged Pex30p using fluorescence microscopy. Further, truncations in the Pex30p sequence were investigated for their effect on localization, interactions and abundance of peroxisomes. For the latter, we performed statistical analyses of the peroxisome number per cell.
In summary, we showed that Pex30p accumulates into distinct spots on the ER. Peroxisomes seem to connect to these Pex30p accumulations, especially when cells were grown on oleate, conditions which induce peroxisome proliferation. Those observations suggest of role of Pex30p in linking peroxisomes to the ER membrane. Further, we showed that truncating one transmembrane region in the Pex30p sequence affected the subcellular localization of this protein as well as its interaction abilities with Rtn1p and Pex11p. Finally, cells expressing the truncated Pex30pΔTMD version exhibit a massive increase in peroxisome number. Our findings allowed us to generate a model for peroxisome proliferation in which the Pex30p-containing complex serves to tether this organelle to the ER membrane.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
peroxisomes peroxins Pex30p membrane proteins methylation assay SDS-electrophoresis western blot TCA-precipitation flurorescence microscopy pulse-chase-experiments
Schlagwörter
(Deutsch)
Peroxisomen Peroxine Pex30p Membranproteine Methylierungsassay SDS-Elektrophorese Westernblot TCA-Präzipitation Fluoreszenzmikroskopie Pulse-Chase-Experimente
Autor*innen
Thomas Heil
Haupttitel (Englisch)
Peroxisome proliferation in the yeast saccharomyces cerevisiae and functional analysis of the membrane protein Pex30p
Paralleltitel (Deutsch)
Peroxisomenproliferation in der Hefe Saccharomyces Cerevisiae und Funktionsanalyse des Membranproteins Pex30p
Paralleltitel (Englisch)
Peroxisome proliferation in the yeast saccharomyces cerevisiae and functional analysis of the membrane protein Pex30p
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
109 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Cecile Brocard
Klassifikation
35 Chemie > 35.00 Chemie: Allgemeines
AC Nummer
AC08796633
Utheses ID
12005
Studienkennzahl
UA | 419 | | |