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Production, purification and characterisation of flavivirus antigens
Georgios Tsouchnikas
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Xaver Franz Heinz
DOI
10.25365/thesis.13370
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29948.53829.444653-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Flaviviren bilden ein Genus in der Familie der Flaviviridae und beinhalten wichtige Krankheitserreger wie Dengue, Japanische Enzephalitis, Gelbfieber (GF), West Nil (WN) und Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME) Viren. Diese Lipid-umhüllten Viren enthalten drei Strukturproteine: Envelope (E), Membrane (M) und Capsid (C). Die Oberfläche der Viren ist durch das große Glycoprotein E und das kleinere Protein M, das durch proteolytische Spaltung seiner Vorläuferform prM entsteht, bedeckt. Die beiden Oberflächenproteine sind in der Virusmembran verankert, die das Nucleocapsid umgibt, welches aus dem einzelsträngigen RNA-Genom positiver Polarität und dem C Protein besteht.
Die Struktur des E Proteins und seiner drei Domänen (DI, DII, DIII) wurde kristallographisch aufgeklärt und seine Anordnung and der Virusoberfläche durch Kryo-Elektronenmikroskopie bestimmt. Wegen der wichtigen Funktionen von E im Zuge des Lebenszyklus von Flaviviren (Rezeptorbindung und Membranfusion) ist dieses Protein der Hauptangriffspunkt von neutralisierenden Antikörpern. Alle drei strukturellen Domänen von E können neutralisierende Antikörper induzieren, die jedoch in ihrer Neutralisationsaktivität variieren. PrM-spezifische Antikörper haben nur geringe bis keine neutralisierende Aktivität, können aber einen beträchtlichen Anteil der polyklonalen Immunantwort nach Flavivirus Infektionen ausmachen. Tatsächlich gibt es wenig Information über die Feinspezifität der polyklonalen Immunantwort nach Flavivirus Infektionen oder Impfungen, und es ist weitgehend unbekannt, ob es Immundominanz bestimmter struktureller Teile von E gibt.
In diesem Zusammenhang war das Hauptziel meiner Diplomarbeit die Produktion und Charakterisierung mehrerer rekombinanter Flavivirus Oberflächenproteine und deren einzelner Domänen. Diese können als Antigene verwendet werden, um die polyklonale Immunantwort nach Flavivirus Infektionen oder Impfungen zu analysieren. Im Detail sollten eine einzelne Domäne von E – die Domäne I (DI) – von FSMEV und WNV, die lösliche Form von prM von FSMEV, WNV und GFV, sowie das pr-Peptid von FSMEV in hochgereinigter Form und richtiger Konformation produziert werden. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Konstrukte von E-DI und pr(M) hergestellt und zur Expression dieser Proteine Drosophila S2 Zellen verwendet. Die Expression und Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie aller gewünschten Flavivirus Proteine wurde etabliert und hohe Erträge aller Proteine wurden erzielt. Evidenz für deren korrekte Faltung wurde durch den Nachweis von Disulfid-brücken und Kohlenhydratketten sowie die Reaktivität mit Konformations-sensitiven monoklonalen Antikörpern und polyklonalen Seren erhalten.
Zusammenfassend wurden rekombinante E-DI von FSMEV und WNV, prM von FSMEV, WNV und GFV, sowie das pr-Peptid von FSMEV in hoher Reinheit und richtiger Konformation produziert. Diese Proteine können nun als Antigene für verschiedene immunologische Untersuchungen verwendet werden, um mehr Aufschluss über die humorale Immunantwort nach Flavivirus Infektionen oder Impfungen zu erhalten.
Abstract
(Englisch)
Flaviviruses form a genus in the family of Flaviviridae and include important human pathogens, like dengue viruses (DENV), Japanese encephalitis virus (JEV), Yellow fever virus (YFV), West Nile virus (WNV) and tick-borne encephalitis virus (TBEV). These lipid-enveloped viruses contain three structural proteins: envelope (E), membrane (M) and capsid (C). The surface of the virions is covered by the large glycoprotein E and the smaller protein M, which is derived by the proteolytical maturation cleavage of its precursor form, the glycoprotein prM. The two surface proteins are anchored in the viral membrane which surrounds the nucleocapsid, consisting of the single stranded, positive-sense RNA genome and the C protein.
As revealed by the combination of x-ray crystallography and cryo-electron microscopy, the E protein is composed of three structural domains (DI, DII, DIII) and forms the major component of the viral surface. Due to its important functions during the flavivirus lifecycle, including receptor binding and membrane fusion, the E protein is the major target for neutralising antibodies. All three structural domains of E can elicit neutralising antibodies, which, however, vary in their potency of neutralisation. Antibodies specific for prM have only low or no neutralising activity, but might form a notable fraction of the polyclonal response after flavivirus infection. Limited information is available about the fine specificity of the polyclonal immune response after flavivirus infection or vaccination and it is largely unknown whether there is an immunodominance of specific structural entities of E.
In this context, the major goal of my thesis was the production and characterisation of several recombinant flavivirus surface proteins and its single domains, which will be used as antigens to dissect the polyclonal immune response after flavivirus infection or vaccination. The specific objectives of this work included the production of a single domain of E – domain I (DI) – of TBEV and WNV, the soluble form of prM of TBEV, WNV and YFV, as well as the pr-peptide of TBEV in correct conformation and high purity. For that purpose, different constructs of E-DI and pr(M) were designed, expressed in Drosophila S2 cells and purified by affinity chromatography. The expression and purification procedures for different flavivirus proteins were established and antigens in high yields and purity were obtained. Evidence for proper folding of recombinant proteins was obtained by demonstrating the presence of disulphide bonds and carbohydrate side chains, as well as by their reactivites with conformation-sensitve monoclonal antibodies (mAbs) and polyclonal sera.
In conclusion, recombinant E-DI of TBEV and WNV, prM of TBEV, WNV and YFV as well as the pr-peptide of TBEV were produced in high purity and proper conformation. These proteins can be used as antigens for different immunological assays to gain more information about the humoral immune response after flavivirus infection and vaccination.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Flavivirus structural proteins E-protein domain I prM purification characterisation
Schlagwörter
(Deutsch)
Flavivirus Strukturproteine E-protein Domäne I prM Aufreinigung Charakterisierung
Autor*innen
Georgios Tsouchnikas
Haupttitel (Englisch)
Production, purification and characterisation of flavivirus antigens
Paralleltitel (Deutsch)
Produktion, Aufreinigung und Charakterisierung flaviviraler Antigene
Paralleltitel (Englisch)
Production, purification and characterisation of flavivirus antigens
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
75 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Xaver Franz Heinz
AC Nummer
AC08791851
Utheses ID
12018
Studienkennzahl
UA | 490 | | |