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Transcriptional regulation of the central MMTV LTR Promoter Complex
Eva Fuchs
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Timothy Skern
DOI
10.25365/thesis.13388
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30076.53061.715365-2
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der zur Gruppe der Betaretroviren zählende Mouse mammary tumor virus (MMTV) verursacht nach einer längeren Latenzphase Tumoren in infizierten Tieren. Die Übertragung dieses Erregers erfolgt dabei durch virale Partikel, welche in die Muttermilch erwachsener weiblicher Tiere abgebeben werden. Im Verdauungstrakt der neugeborenen Mäuse befällt der Virus zunächst die Zellen des lymphatischen Gewebes; erst danach wird die Brustdrüse befallen. Die dort befindlichen Epithelzellen werden infiziert, jedoch werden nur marginal virale Proteine gebildet. Die Latenzphase endet, sobald der Hauptpromoter des LTR, P1, durch Glucocorticoide aktiviert wird.
Im Gegensatz zu anderen Retroviren, wurde bei MMTV ein zusätzliches Promoterelement innerhalb des LTR gefunden. Dieser P2 genannte Promoter wurde ursprünglich als ebenfalls hormonabhängig beschrieben. Allerdings konnte bis heute kein transkriptionelles Produkt dieses Promoters gefunden werden. Um die Regulation des Promoters P2 im Detail zu untersuchen, haben wir ein sensitives Reportersystem verwendet, welches auf der Expression des Luciferasegens basiert. Unerwarteterweise, haben wir dabei einen weiteren Promoter, P3, entdeckt, der sich in 3' Richtung in unmittelbarer Nachbarschaft zu P2 befindet. Bedingt durch ihre Nähe scheinen beide Promoterelemente einen Komplex im zentralen Teil des LTR von MMTV zu bilden.
Wir konnten zeigen, daß beide Promotoren durch einen in 3' Richtung befindlichen Enhancer reguliert werden. Der Promoter P2 wird zusätzlich von einem in 5' Richtung gelegenen Negativen Regulatorischen Element (NRE) beeinflußt. Weiters konnten wir zeigen, daß die konstitutive transkriptionelle Aktivität des P2/P3 Promoter Komplexes mit einer DNase hypersensitiven Stelle einhergeht, welche sich am zugehörigen Nucleosome feststellen ließ. Damit verbunden, konnten wir einen erhöhten Methylierungszustand der Lysine 4 und 36 des Histonproteins H3 (desselben Nucleosomes) detektieren. Beide Modifikationen werden hauptsächlich in Zusammenhang mit transkriptinell aktiven Region gefunden.
Unabhängig von hormoneller Stimulation, konnten wir eine doppelt gesplicte mRNA identifizieren, welche am Promoterkomplex ihren Ausgang nimmt. Wir konnten weiters zeigen, daß die Menge an Transkript durch die Aktivität von Histone Deacetylasen beeinflußt wird, da die Verwendung des Histone Deacetylasen Inhibitors Trichostatin A (TSA) zu einer konzentrationsabhängigen Abnahme der neu entdeckten mRNA führte. Begleitet wurde diese Abnahme von einer gleichzeitigen Zunahme an Acetyl-Resten des entsprechenden Nucleosomes. Damit übereinstimmend, konnten wir eine hohe Konzentration des Enzymes Histone Deacetylase 1 an der P2/P3 Promoterregion feststellen.
Schließlich konnten wir zeigen, daß der Transkriptionsfaktor CCAAT displacement protein (CDP) einen spezifischen Regulator des Promoterkomplexes darstellt. Durch Bindung an das NRE vermindert CDP die transkriptionelle Aktivität des P2 Promoters, wodurch das Auftreten des doppelt gesplicten Transkripts mit frühen Phasen der Zelldifferenzierung und damit mit der Latenzphase des Virus in Verbindung gebracht werden kann.
Abstract
(Englisch)
Mouse mammary tumor virus (MMTV) is a non-acute transforming Betaretrovirus that is transmitted by viral particles present in the mother's milk. Upon digestion, the virus infects and replicates in the cells of the lymphatic system until it finally reaches the mammary gland epithelial. There, the integrated virus remains silent until its major LTR promoter, P1, is activated by glucocorticoid hormones.
Uniquely among retroviruses, MMTV harbours a further promoter element within its LTR. The P2 promoter has been described as being enhanced in the presence of glucocorticoids. However, as yet, no transcriptional product of P2 has been related to its activity. To examine the regulation of P2 in more detail, we used a sensitive reporter gene assay based on luciferase expression. Unexpectedly, we detected another promoter during this analysis, P3, which is located immediately downstream of the P2 promoter. Both promoter elements appear to form a complex in the central part of the MMTV LTR.
We could show that both promoters are regulated by a downstream located enhancer. In contrast, only the activity of the P2 promoter is influenced by an upstream located negative regulatory element (NRE). Furthermore, we were able to relate the constitutive transcriptional activity originating from the P2/P3 promoter complex with a DNase hypersensitive site at the corresponding nucleosome. Additionally, we could demonstrate that this open chromatin formation is associated with elevated methylation levels at lysine 4 and lysine 36 of histone H3, respectively. Both modifications are predominantly found in transcriptionally active regions.
Independent of glucocorticoid stimulation, we were able to identify a doubly spliced message initiating from the complex. Moreover, we could demonstrate that the level of this transcript is regulated by the activities of histone deacetylases (HDACs). Incubation with the HDAC inhibitor trichostatin A (TSA) lead to a concentration dependent reduction of the doubly spliced messenger RNA, which was accompanied by increasing acetylation levels of the corresponding nucleosome. Congruently, we detected a tight association of the histone deacetylase 1 (HDAC1) to the region of the P2/P3 promoter complex.
Finally, we could show that the transcription factor CCAAT displacement protein (CDP) is a specific regulator of the promoter complex. By binding to the NRE, CDP downregulates the transcriptional activity of the P2 promoter. Thereby, the emergence of the doubly spliced message is intimately linked to early stages of cell differentiation and thus to the latency phase of the virus.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Retroviruses Mouse Mammary Tumor Virus Transcriptional Regulation Post-translational Modifications
Schlagwörter
(Deutsch)
Retroviren Mouse Mammary Tumor Virus Transkriptionelle Regulation Post-translationale Modifikation
Autor*innen
Eva Fuchs
Haupttitel (Englisch)
Transcriptional regulation of the central MMTV LTR Promoter Complex
Paralleltitel (Deutsch)
Transkriptionelle Regulation des zentralen MMTV LTR Promoter Komplexes
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
134 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Dieter Blaas ,
Alexandra Lusser
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC08744979
Utheses ID
12034
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |