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An in vivo RNAi approach to study gene function in hematopoiesis

Marie-Theres Tazreiter

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Josef Penninger

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DOI

10.25365/thesis.13649

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29253.84696.734554-8

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Hämatopoiese beschreibt den entwicklungbiologischen Vorgang der Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen zu den verschiedenen Blutzellytpen [Tavian et al., 2010]. Aufgrund der Kurzlebigkeit von Blutzellen, müssen täglich mehrere Millionen Blutzellen neu vom Knochenmark gebildet werden. Dieser hohe “Turnover” erfordert ein stetiges Gleichgewicht zwischen den Prozessen Wachstum, Differenzierung und Zelltod, um die Homöostase des dynamischen Blutsystems zu garantieren [Dingli and Pacheco, 2010]. Eine Störung dieses Gleichgewichts kann verschiedene hämatologische Erkrankungen wie Lymphome, Leukämien oder Autoimmunerkrankungen zur Folge haben [Kondo et al., 2003]. Anhand eines blut-spezifischen, RNAi-basierenden Screens in der Drosophila Larve wurden 356 konservierte Gene identifiziert, die an der Regulation der Blutbildung in der Fruchtfliege beteiligt sind [Elling et al., unveröffentlicht]. Die fehlende Expression einiger dieser Gene in den Blutzellen der Larve führte zur Entstehung einer sogenannten “Fliegenleukämie”, die sich durch eine stark vermehrte Bildung von Makrophagen-ähnlichen Plasmatozyten und das Auftreten von stark pigmentierten Tumoren, sogenannten “melanotic tumors”, auszeichnet. Zu den Genen, die zu einem besonders starken Phänotyp in der Fliege führten, zählen der Proteaseinhibitor Papilin, zwei transkritionelle Koregulatoren namens Symplekin und Ssrp1, und mehrere Faktoren, die an der Regulation der Endozytose beteiligt sind, nämlich die kleine GTPase Rab5a, das SNARE Protein Syntaxin 7 sowie zwei Untereinheiten des HOPS/ CORVET-Komplexes namens Vps16 und Vps33a. Durch die Analyse von Knochenmarkchimären, haben wir getestet, ob die genannten Gene auch bei der Blutbildung in Säugetieren eine Rolle spielen. In unseren Versuchen wurde die Expression des jeweils zu untersuchenden Gens in Vorläuferzellen aus dem Knochenmark hinunterreguliert. Anschließend wurde die Fähigkeit dieser Vorläuferzellen in die verschiedenen Blutzelllinien zu differenzieren durch deren Transplantation in Mäuse getestet. Vorläuferzellen, die eine verminderte Expression von entweder Symplekin, Rab5a oder Vps16 aufwiesen, entwickelten sich bevorzugt zu reifen oder unreifen myeloiden Blutzellen, während diese Vorläuferzellen seltener zu B- oder T-Lymphozyten differenzierten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die sogenannte “lineage decision” beeinträchtigt sein könnte. Außerdem förderte die Herabregulation der selben Gene eine vermehrte Bildung von natürlichen Killerzellen in der Milz der Rezipienten. Weiters konnten wir zeigen, dass die Granulozytenpopulation im peripheren Blut von Papilin Knockout-Mäusen vermindert ist. Dieser Befund korrelierte mit einem niedrigeren Prozentsatz von myeloiden Vorläuferzellen im Knochenmark dieser Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Unsere Resultate deuten darauf hin, dass die konservierten Gene, die ursprünglich als Regulatoren für die Blutbildung und Homöostase in Fruchtfliegen identifiziert wurden, auch eine Role in der Regulation der Hämatopoiese in Säugetieren spielen.

Abstract

(Englisch)

Hematopoiesis is a developmental process in which hematopoietic stem cells give rise to a variety of blood cell types with different morphologies and diverse functions [Tavian et al., 2010]. The hematopoietic compartment is a highly dynamic system composed of relatively short-lived cells of which millions are newly generated by the bone marrow every day and thus needs to be tightly regulated by a fine balance between proliferation, differentiation and apoptosis [Dingli and Pacheco, 2010]. Consequently, deregulation of hematopoietic differentiation or homeostasis builds the basis for various hematopoietic disorders such as lymphomas, leukemias or autoimmune diseases [Kondo et al., 2003]. Using blood cell-specific RNAi silencing in Drosophila larvae, a screen of evolutionarily conserved genes for hematopoiesis identified 356 genes implicated in blood cell homeostasis in the fly [Elling et al., unpublished]. The genes causing the strongest phenotypes, namely “fly leukemia” characterized by marked overproliferation of macrophage-like plasmatocytes and formation of melanotic tumors, included amongst others the protease inhibitor Papilin, two transcriptional co-regulators called Symplekin and Ssrp1 as well as several genes involved in the regulation of endocytosis: the small GTPase Rab5a, the SNARE protein Stx7 and the two HOPS/CORVET complex subunits Vps16 and Vps33a. In order to characterize the relevance of these identified factors in the mammalian hematopoietic system in vivo, we applied a bone marrow chimeric approach to test the hematopoietic potential of bone marrow cells with down-regulated expression of either of these genes. The knock-down of three of the analyzed genes, namely Symplekin, Rab5a and Vps16, resulted in an increase of either mature or immature myeloid cells in lethallyirradiated recipient mice, while promoting a decreased percentage of lymphoid B- or T-cells, indicating an impairment of lineage decision in favor of the myeloid lineage. Moreover, the down-regulation of the same genes in bone marrow cells was associated with an elevated percentage of innate natural killer cells in the spleens of transplanted mice. Analysis of the hematopoietic compartment of Papilin mutant mice revealed that these mice harbor decreased numbers of granulocytes in the peripheral blood which correlated with a significant reduction in the percentage of c-kit+ myeloid precursor cells in the bone marrow. These data indicate that the conserved factors identified to regulate proliferation and homeostasis of blood cells in the fruit fly Drosophila melanogaster directly translate into conserved mammalian genes involved in hematopoiesis.

Autor*innen

Marie-Theres Tazreiter

Haupttitel (Englisch)

An in vivo RNAi approach to study gene function in hematopoiesis

Paralleltitel (Deutsch)

RNAi-basierende in-vivo Analyse relevanter Gene der Hämatopoese

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

94 S. : Ill, graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Josef Penninger

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik

AC Nummer

AC08883073

Utheses ID

12266

Studienkennzahl

UA | 490 | | |

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Schlagwörter