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Determinants of the initiation of meiotic recombination

Bernd Edlinger

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Dieter Schweizer

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DOI

10.25365/thesis.13775

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29566.97913.375753-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Spo11, zuerst in Saccharomyces cerevisiae beschrieben, ist ein eukaryotisches Homolog der archealen DNS Topoisomerase VIA Untereinheit und ist für die Bildung von DNS Doppelstrangbrüchen (DSB) während der Meiose notwendig. Die DNS wird bevorzugt an bestimmten Stellen im Genom, welche meiotische Rekombinations Hotspots genannt werden, geschnitten. Nach dem DNS Schnitt wird Spo11 mit einem kovalent gebundenen Oligonukleotid von der Bruchstelle gelöst. Diese kurze einzelsträngige DNS Sequenz entspricht genau dem Ort des Doppelstrangbruches. Das Arabidopsis thaliana Genom kodiert, anders als bei Säugern und Hefe, wo es nur ein Spo11 gibt, für drei Spo11 Homologe, AtSPO11-1, AtSPO11-2 und AtSPO11-3. Nur AtSPO11-1 und AtSPO11-2 sind für die Meiose notwendig, während AtSPO11-3 an der somatischen Endoreduplikation beteiligt ist. Bei S. cerevisae sind zusätzlich zu Spo11 zumindest 9 andere Proteine an der DSB Bildung beteiligt. Bei Arabidopsis sind bisher nur die drei Proteine AtPRD1, AtPRD2 und AtPRD3, als essentiell für die SPO11 abhängige DSB Bildung, identifiziert worden. Das Hauptthema dieser Arbeit war die Entwicklung eines Protokolls, um genomweit DSB Stellen in Arabidopsis thaliana zu identifizieren. Zuerst wurde ein Deep-Sequencing basierendes Protokoll unter Zuhilfenahme eines Modellsubstrates, einem HRP Protein gekoppelt an ein 30 Nukleotide langes Oligonukleotid, entwickelt und optimiert. Nach der erfolgreichen Optimierung der einzelnen Reaktionsschritte und der Sequenzierung wurden Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe verwendet, um die Methode zu testen und die Resultate mit denen von bereits publizierten DSB Karten zu vergleichen. Die Resultate für beide Hefen waren sehr gut reproduzierbar und es wurde eine gute Übereinstimmung mit den genomischen Hotspot Karten, die bereits mit anderen Methoden produziert wurden, gefunden. Um diese Methode auf Arabidopsis thaliana zu übertragen, wurde eine transgene Linie, welche eine funktionelle, getaggte Version von AtSPO11-1 (AtSPO11-1/18xmyc) exprimiert, generiert. Das Protein wurde erfolgreich aus Pflanzenmaterial, welches meiotische Zellen enthält, präzipitiert und für das oben genannte Protokoll verwendet. Die ersten Deep-Sequencing Durchgänge, welche mit Arabidopsis Material durchgeführt wurden, brachten 3,5 Millionen und 2,2 Millionen Sequenzen, welche zum Arabidopsis Genom passen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die gezielte Stimulation von meiotischer Rekombination in A. thaliana. Eine spezifische DNS Bindedomäne wurde an den C-Terminus von AtSPO11-1 fusioniert (AtSPO11-1/Gal4) und es wurden Pflanzen hergestellt, die korrespondierende Cis-Elemente (5xUAS) tragen. Nach dem Kreuzen der Pflanzen mit den vorher genannten Features wird erwartet, dass AtSPO11-1/Gal4 an die 5xUAS Stellen bindet, um in weiterer Folge die Bildung von meiotischen Doppelstrangbrüchen zu stimulieren. Weiters wurde versucht, Interaktionspartner von AtSPO11-1 und AtSPO11-2 zu finden. Für diesen Zweck wurden verschiedene Strategien, wie Massenspektrometrie, direkte Yeast two-hybrid Interaktion und Co-Immunopräzipitation verwendet.

Abstract

(Englisch)

Spo11, first described in Saccharomyces cerevisiae, is a eukaryotic homolog of the archeal DNA topoisomerase VIA subunit and is needed for the formation of DNA double strand breaks (DSBs) during meiosis. DNA is preferentially cleaved at certain sites in the genome, called meiotic recombination hotspots. After DNA cleavage, the Spo11 protein is released from the cleavage site with a short DNA oligonucleotide covalently attached. This short ssDNA sequence corresponds to the exact meiotic DSB cleavage site. The Arabidopsis thaliana genome encodes, unlike the ones of mammals and yeast, where only one Spo11 is present, three Spo11 homologs, AtSPO11-1, AtSPO11-2 and AtSPO11-3. Only AtSPO11-1 and AtSPO11-2 are essential for meiosis, whereas AtSPO11-3 is needed for somatic endoreduplication. In S. cerevisiae, in addition to Spo11, at least 9 other proteins are essential for meiotic DSB formation. In Arabidopsis only three further proteins, AtPRD1, AtPRD2 and AtPRD3, have been identified to be essential for SPO11 mediated meiotic DSB formation. The main topic of this thesis was the development of a protocol for the identification and detailed analysis of meiotic DSB sites in the model plant Arabidopsis thaliana. First, a deep-sequencing based protocol was developed and optimized using an HRP protein, conjugated to a 30mer oligonucleotide, as a model substrate. After successful optimization of the individual reactions steps and the deep-sequencing pipeline, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe were used as model organisms to verify the method and to compare the results to known DSB maps. Results for both yeasts were very well reproducible and found very good overlap with genome-wide hotspot maps generated earlier by other methods. To implement the method in the higher eukaryote Arabidopsis, a transgenic line expressing a functional, tagged version of AtSPO11-1 (AtSPO11-1/18xmyc) was generated. AtSPO11-1/18xmyc could be successful immuno-precipitated from plant material containing meiotic cells and be used in the protocol mentioned above. The first two deep-sequencing runs, using material from Arabidopsis have been performed, yielding 3.5 million and 2.2 million sequence reads that mapped to the Arabidopsis genome. An additional aim of this thesis was the targeted stimulation of meiotic recombination in A. thaliana. A specific DNA binding domain was fused to the C-terminus of AtSPO11-1 (AtSPO11-1/Gal4) and plant lines carrying corresponding cis-elements (5xUAS) were generated. After crossing plants with aforementioned features it is anticipated that the tagged AtSPO11-1 will be guided to the cis-elements and stimulate formation of meiotic DSBs. Furthermore it was aimed to find AtSPO11-1 and AtSPO11-2 interacting proteins. For this purpose, different approaches like mass spectrometry, direct yeast two-hybrid interaction and co-immuno-precipitation were used.

Autor*innen

Bernd Edlinger

Haupttitel (Englisch)

Determinants of the initiation of meiotic recombination

Paralleltitel (Deutsch)

Faktoren der Initiation von meiotischer Rekombination

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

168 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Gregory Copenhaver ,

Ortrun Mittelsten Scheid

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.43 Pflanzengenetik

AC Nummer

AC08768590

Utheses ID

12376

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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