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Time dependent changes during hydroxyurea induced senescence in MYCN amplified neuroblastoma
Heide-Marie Binder
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Heinrich Kovar
DOI
10.25365/thesis.1562
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30307.16615.713259-0
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Neuroblastoma ist die häufigste Art von extracranialen, soliden Tumoren bei Kindern. Häufig treten Amplifikationen des MYCN Gens auf, die im Zellkern als double minute chromosomes oder als homogenous staining region vorliegen.
Durch Behandlung mit niedrigen Dosen von Hydroxyurea (HU) können die amplifizierten MYCN Genkopien selektiv aus dem Zellkern geschleust werden und in Mikrokernen nachgewiesen werden. Außerdem wurde in den malignen Neuroblastomzellen nach einer sechswöchigen niedrig dosierten Behandlung mit HU zelluläre Seneszenz nachgewiesen. In gutartigen humanen Zellen wird diese zelluläre Veränderung durch irreversiblen Proliferationsstillstand gekennzeichnet, was durch cyclin dependent kinases inhibitors (CDKI) und Aktivierung von p53 und pRb bedingt wird. Weiters wird Seneszenz durch erhöhte mitochondriale Radikalfreisetzung und Änderung der Komponenten der Kernmatrix- und -membran gekennzeichnet.
Das Ziel dieser Diplomarbeit war es Kandidaten-Signalwege zu erforschen, die im Prozess der Hydroxyurea induzierten Seneszenzentstehung in MYCN amplifizierten Neuroblastomazellen wichtig sind.
Dafür wurden zeitliche Veränderungen des Zellzyklus, des zellulären Sauerstoffradikalgehalts und der mitochondrialen Begebenheiten wie Membranpotential und Masse während der HU Behandlung mittels Durchflußzytometrie ermittelt. Mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie wurden zusätzlich die Kernmorphologie und Komponenten der nukleären Matrix ermittelt. Proteinanalysen der CDKIs sowie von assoziierten Proteinen und von MYCN erfolgten mittels Western Blot.
Wesentliche Resultate zeigten, dass nach 3-5 Tagen HU Behandlung die Zellen in der S-Phase des Zellzyklus akkumulierten. Im gleichen Zeitfenster wurde p16 reduziert und p53 erhöht nachgewiesen. Von Tag 10 an wurde eine Reduktion des MYCN- und pRb-Proteinlevels nachgewiesen und die Anzahl der Zellen die sich in G1-Phase befanden erhöhte sich. Zusätzlich stieg der p21 Proteingehalt an und p16 erhöhte sich wieder.
Während der achtwöchigen Behandlung akkumulierten stetig Sauerstoffradikale zu einem 13-fachen Anstieg. Auch die Mitochondrien erreichten eine 3.4-fache Masse und hatten ein zur Hälfte reduziertes Membranpotential. Zuvor fehlendes Lamin A/C wurde in 67% der 8 Wochen behandelten Zellen gefunden und die Kernhülle dieser Zellen war verformt und lobuliert.
In HU behandelten MNA-NB Zellen könnte Seneszenz durch Akkumulation von oxidativem Stress, durch p21-p53 Induktion, durch Aufhebung der MYCN Expression und durch Änderung der Kernstruktur entstehen.
Abstract
(Englisch)
Neuroblastoma (NB) is the most common extra-cranial solid childhood tumour, frequently associated with MYCN amplification (MNA). Selective expulsion of double-minute chromosomes, carrying the amplified gene can be induced by low dose hydroxyurea (HU) treatment. Moreover, chronic low-dose HU induces senescence after six weeks in malignant neuroblastoma cells. In benign human cells, key pathways of senescence-associated irreversible proliferation arrest involve cyclin dependent kinases inhibitors (CDKI) and activation of p53 and pRb. In addition, cellular changes in senescent cells include increased mitochondrial radical levels and alterations of components of the nuclear lamina.
The aim of this study was to investigate candidate pathways involved in HU-induced senescence of MNA NB cells.
Thus, time dependent changes of cell cycle, reactive oxygen species (ROS), mitochondrial mass and membrane potential m were assessed by flow cytometry. Furthermore, nuclear morphology and lamina composition was monitored by immune fluorescence microscopy. Expression of CDKIs and associated proteins was determined by western blotting together with MYCN.
We found that cells accumulated in S-phase 1 – 5 days after treatment accompanied by decrease in p16 and increase in p53 expression. From day 10 onwards a descent in MYCN and pRb was found and the proportion of cells in the G1-phase increased. Additionally, p21 rose and p16 recovered. ROS levels accumulated steadily to13-fold after 8 weeks and mitochondria were increased 3.4-fold in mass with 50% decrease in mitochondrial membrane potential. Previously lacking lamin A/C was expressed in 67% and the nuclear envelope was lobular in senescent cells after 8 weeks HU-treatment.
In MNA NB cells, senescence may be induced by accumulating oxidative stress leading to p53-p21 induction, abrogation of MYCN expression and finally changes in nuclear structure.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
senescence hydroxyurea neuroblastoma ROS lamin
Schlagwörter
(Deutsch)
Seneszenz Hydroxyharnstoff Neuroblastoma ROS Lamin
Autor*innen
Heide-Marie Binder
Haupttitel (Englisch)
Time dependent changes during hydroxyurea induced senescence in MYCN amplified neuroblastoma
Paralleltitel (Deutsch)
Zeitbedingte Veränderungen während Hydroxyharnstoff induzierter Seneszenz in MYCN amplifizierten Neuroblastoma
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
107 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Heinrich Kovar
AC Nummer
AC07652972
Utheses ID
1244
Studienkennzahl
UA | 490 | | |