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Establishment and characterization of a novel secretion system in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
Silvia Heiss
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Christoph Schüller
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29969.50045.568862-0
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris gilt als beliebtes Expressionssystem zur Produktion von rekombinanten Proteinen. Die Verfügbarkeit sowohl von starken Promotoren (z.B. der Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase Promoter, PGAP und den Promoter der Alkohol Oxidase, PAOX1) und effizienten Sekretionssignalen (alpha mating factor Sekretionssignal; MF1αpp), als auch eine funktionierende Proteinfaltung und das Anfügen von post-translationalen Modifikationen sind vorteilhaft. Das extrazelluläre Protein X (Epx1) wurde als stark sekretiertes, jedoch unbekanntes Protein im Überstand von P. pastoris bemerkt. Wenig ist bekannt über Epx1, außer dass es eines von 20 endogen sekretierten Proteinen ist und der C-Terminus mit einer SCP-ähnlichen (sekretiert und Cystein-reich) extrazellulären Proteindomäne überein stimmt. Die Anwendbarkeit als neues Sekretionssystem für rekombinante Proteine wurde anhand von intrazellulärer eGFP Expression durch den Promoter (1.000 bp oberhalb des ATG) auf drei unterschiedlichen Kohlenstoffquellen getestet. PEPX1 zeigte keine verbesserte eGFP Sekretion, verglichen mit PGAP. Weiters wurde das Epx1 Sekretionssignal mit drei strukturell und funktionell unterschiedlichen Proteinen analysiert (pTRP, porcines Trypsinogen; HSA, humanes Serumalbumin; eGFP, verbessertes grün-fluoreszierendes Protein). Dadurch wurde eine neue und effiziente Sekretionssequenz für die Produktion rekombinanter Proteine etabliert.
Abstract
(Englisch)
The methylotrophic yeast Pichia pastoris is successfully used for recombinant protein production. The application of strong promoters (e.g. the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter PGAP, and the alcohol oxidase promoter, PAOX) and efficient secretion signals (alpha mating factor secretion leader; MFα1pp) as well as proper folding and post- translational modifications are beneficial. The extracellular protein X (Epx1) was detected as unknown, strongly secreted host protein in supernatants. As one of 20 endogenous secreted proteins in P. pastoris, little is known about Epx1 except C-terminal alignment with the SCP-like (secretory cysteine rich) extracellular protein domain. Therefore, the practicability as novel secretion system for enhancing recombinant protein expression was tested. The promoter sequence (1,000 bp upstream of ATG) was used to analyze intracellular eGFP expression. The Epx1 promoter, tested at three different carbon sources, was weaker in expressing eGFP compared to PGAP. Furthermore, secretion and processing mediated by Epx1 secretion leader was studied on three structurally and functionally different recombinant proteins: pTRP (porcine trypsinogen), HSA (human serum albumin), and eGFP (enhanced green fluorescent protein). Thereby we established a novel and efficient secretion leader system for the production of recombinant proteins.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
yeast Pichia pastoris secretion recombinant proteins secretion sequence
Schlagwörter
(Deutsch)
Hefe Pichia pastoris Sekretion rekombinante Proteine Sekretionssequenz
Autor*innen
Silvia Heiss
Haupttitel (Englisch)
Establishment and characterization of a novel secretion system in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
Paralleltitel (Englisch)
Etablierung und Charakterisierung eines neuen Sekretionssystems in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
100 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christoph Schüller
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC08979750
Utheses ID
12508
Studienkennzahl
UA | 490 | | |
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