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Generation of tick-borne encephalitis virus with mutations in the fusion protein E
Janja Blazevic
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Karin Stiasny
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.14074
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29873.76725.304766-2
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Die Membranfusion ist ein essentieller Schritt im Infektionsprozess umhüllter Viren und wird durch spezifische membranverankerte virale Oberflächenproteine (Fusionsproteine) vermittelt. Auf Grund ihres molekularen Aufbaus werden diese Proteine in drei unterschiedliche strukturelle Klassen eingeteilt (Klasse I, II und III). Sie alle bewirken Fusion durch Konformationsänderungen, die durch Interaktionen mit der Wirtszelle (wie z.B. Rezeptorbindung oder sauren pH) ausgelöst werden, wobei vermutlich Protein-Protein Wechselwirkungen am Fusionsort beteiligt sind. Flaviviren sind umhüllte Viren, die eine Reihe von humanen Pathogenen umfassen wie Gelbfieber Virus, Dengue Virus, Japanische Enzephalitis Virus (JEV), West Nil Virus und Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSMEV). Diese Viren dringen durch rezeptorvermittelte Endozytose und anschließende Fusion ihrer Membran und der endosomalen Membran in Wirtszellen ein. Das Hüllprotein E („envelope“), ein virales Klasse II Fusionsprotein, ist für den Fusionsprozess verantwortlich. Der saure pH Wert der Endosomen löst die konformationelle Reorganisation vom metastabilen E Homodimeren in post-Fusions-Trimere aus. Die Kristallstrukturen von löslichen verkürzten E Proteinen verschiederner Flaviviren, denen die sogenannte „Stamm“-Region und der doppelte Membrananker fehlen, wurden vor und nach der säure-induzierten Umlagerung geklärt. Bemerkenswert ist, dass das E Protein als einziges bekanntes virales Fusionsprotein einen doppelten Transmembrananker besitzt, der aus zwei antiparallel angeordneten Transmembranhelices (TM1 und TM2) besteht. Diese sind für das intrazelluläre Sortieren und Prozessieren des viralen Polyproteins erforderlich. Unter Verwendung von rekombinanten subviralen Partikeln (RSP) des FSME Virus, die verkürzte und chimäre (mit heterologen JEV TM Segmenten) Formen des E Proteins enthalten, konnte gezeigt werden, dass beide TM Helices für eine effiziente Fusion notwendig sind. Funktionelle Analysen wiesen darauf hin, dass TM Interaktionen offenbar zur Stabilität des post-Fusions-Trimer und zur Vervollständigung des Fusionsprozesses der beiden Membranen beitragen. Ziel dieser Diplomarbeit war es, die Bedeutung der Beobachtungen mit RSP TM Mutationen im infektiösen FSMEV System zu verifizieren. Hierfür wurden heterologe und chimäre Membrananker in infektiöse FSMEV cDNA Klone eingebracht. Rekombinante FSME Viren mit einem gänzlich heterologen TM Anker oder chimären TM Ankern zeigten eine dramatische Reduktion der spezifischen Infektiösität und eine starke Beeinträchtigung der Virusvermehrung. Dadurch war es nicht möglich, mutierte Viren in ausreichender Menge für in vitro Fusionsexperimente herzustellen. Die in dieser Diplomarbeit gewonnene Daten deuten darauf hin, dass Modifikationen der TM Helices im Virus nicht nur die Fusion beeinflussen, sondern auch zusätzliche Schritte des viralen Lebenszyklus wie Partikelaufbau („Assembly“) betreffen. Im zweiten Teil dieser Diplomarbeit sollte die Funktion von konservierten Histidinen im E Protein als pH Sensoren für die Flavivirus Membranfusion in infektiösen FSME Viren analysiert werden. Eine vorangegangene Studie unter Verwendung von FSMEV RSPs hatte gezeigt, dass ein Histidin an der Schnittstelle zwischen zwei Domänen für die saure pH-induzierte Einleitung der Fusion wichtig ist. Es wurde spekuliert, dass ein zweites Histidin in dieser Region (welches jedoch im RSP System nicht untersucht werden konnte) ebenfalls an diesem Prozess beteiligt sein könnte. Der Austausch eines dieser Histidine führte in FSME Viren zu einer 10-fachen Reduktion der Infektiosität der Mutanten im Vergleich zum Wildtyp und die Kombination der beiden Mutanten ergab sogar eine 100-fache Reduktion der Infektiosität. Die Produktion dieser Mutanten liefert nun die Grundlage für weitere Studien einschließlich der Analyse der spezifischen Infektiosität und Fusionsaktivität nach Virusproduktion im Großmaßstab, um die Funktion von Histidine als pH Sensoren im infektiösen System untersuchen zu können.
Abstract
(Englisch)
Membrane fusion is a crucial step during the cell entry of enveloped viruses and is driven by specific membrane-anchored viral surface proteins (fusion proteins). According to their molecular architecture these proteins have been assigned to three different structural classes (class I, II, and III). They all drive fusion by conformational changes that are triggered by interactions with the host cell (such as receptor binding or exposure to acidic pH) and presumably involve protein-protein interactions at the fusion site. Flaviviruses are small enveloped viruses and comprise several human pathogens like yellow fever virus, dengue virus, Japanese encephalitis virus (JEV), West Nile virus, and tick-borne encephalitis virus (TBEV). These viruses enter the host cells by receptor mediated endocytosis followed by fusion in the endosome mediated by the envelope protein E, a class II viral fusion protein. The acidic pH in the endosome triggers the conformational reorganization from metastable pre-fusion E homodimers into post-fusion trimers. The crystal structures of truncated E proteins, lacking the so-called ‘stem’-region and the membrane anchor, are known in their pre- and post-fusion conformations. The E protein is the only known viral fusion protein with a double membrane anchor, consisting of two antiparallel transmembrane helices (TM1 and TM2), required for intracellular sorting and processing of the viral polyprotein. Using recombinant subviral particles (RSPs) of TBEV with truncated and chimeric forms of protein E (containing heterologous JEV TM segments) it was shown that both TM helices are essential for efficient fusion. Functional analyses demonstrated that TM interactions apparently contribute to the stability of the post-fusion trimer and the completion of the merger of the membranes. In this diploma thesis we were interested to assess the significance of the observations made with RSP TM mutations in the context of infectious virions, heterologous and chimeric membrane anchors were introduced into an infectious cDNA clone of TBEV. The studies revealed that recombinant TBE viruses with a completely heterologous TM anchor or chimeric TM anchors had dramatically reduced specific infectivities. They were also severely impaired in their virus growth properties thus prohibiting the production of sufficient amounts of mutant viruses for in vitro fusion experiments. The data obtained in this work suggest that modifications of the TM helices in the virus not only affected fusion, but also additional steps of the virus life cycle such as particle assembly. In the second part of this diploma thesis, the role of conserved histidines in the E protein as pH sensors for triggering flavivirus membrane fusion were analysed in the context of infectious TBEV. A previous study using TBEV RSPs revealed that one histidine at an interface between two domains was important for the acidic-pH-induced initiation of fusion and a second histidine at this interface (which could not be investigated with RSPs) was speculated to be also involved in this process. Replacement of these histidines in infectious TBE virions led to a 10-fold reduced infectivity of the mutants compared to wild type and the combination of both mutants yielded even a 100-fold reduced infectivity. The generation of these mutants now provides the basis for further experiments to analyze the pH sensor in an infectious system, including the determination of specific infectivities and fusion activities of the histidine mutants after up-scaling of virus productions.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Flavivirus tick-borne encephalitis virus TBE membrane fusion fusin protein E pH sensor transmembrane anchor
Schlagwörter
(Deutsch)
Flaviviren Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus FSME Membranfusion Fusionsprotein E pH Sensor Transmembrananker
Autor*innen
Janja Blazevic
Haupttitel (Englisch)
Generation of tick-borne encephalitis virus with mutations in the fusion protein E
Paralleltitel (Deutsch)
Herstellung von Frühsommer-Meningoenzephalitis Viruen mit Mutationen im Fusionsprotein E
Paralleltitel (Englisch)
Generation of tick-borne encephalitis virus with mutations in the fusion protein E
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
70 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Karin Stiasny
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.32 Virologie
AC Nummer
AC08580089
Utheses ID
12640
Studienkennzahl
UA | 490 | | |
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