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Extraction off egg white allergens from food stuff and determination of the influence of buffer components in indirect competitive ELISA
Corinna Kern
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Marcela Hermann
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29849.72771.283469-3
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Der Schwerpunkt der vorliegenden Diplomarbeit liegt in der Optimierung eines Puffers zur Extraktion von Hühnereiweißallergenen aus prozessierten Lebensmitteln. Zusätzlich wurde der Einfluss der Pufferkomponenten auf die Bindungsreaktion zwischen Antigen und Antikörper untersucht und ein Vergleich zwischen extrahiertem Gesamtprotein und Signalstärke im indirekten competitive ELISA erstellt. Dazu wurden vier verschiedene polyklonale Antikörper aus Hasen verwendet, welche mit Sprüheiweiß, rohem Hühnereiweiß, nativem Ovomucoid und erhitztem Ovomucoid immunisiert wurden. In den ersten Ansätzen wurden Puffer aus verschiedenen Literaturquellen miteinander verglichen, welche allgemein zur Proteinextraktion verwendet worden waren. Die Zusammensetzung der Proteinextrakte wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot bestimmt, und die Gesamtkonzentration an Protein wurde mit Hilfe eines BCA-Testkits gemessen. Danach wurde der notwendige Einsatz von denaturierenden Agenzien wie Urea oder SDS ersichtlich, welche den Proteingehalt der Extrakte um ein Vielfaches steigerten. Nach anschließender Messung der Extrakte im indirekt kompetitiven ELISA, wurde allerdings ein negativer Effekt der Agenzien festgestellt. Im Falle von Natriumdodecylsulfat konnte der inhibierende Einfluss des anionischen Detergens auf die Antigen-Antikörper Bindung durch die Zugabe von nonionische Detergentien (z.B. Brij 35) fast gänzlich aufgehoben werden. Allerdings eignete sich SDS nur als Pufferzusatz für die Proteinextraktion, wenn die Detektion im ELISA mit den Antikörpern gegen Sprüheiweiß und gegen rohes Hühnereiweiß erfolgte. Weiters konnte festgestellt werden, dass Dithiothreitol als Reduktionsmittel die Extraktion von Ovalbumin und Ovomucoid aus denaturierten Lebensmitteln erleichtert, indem es Disulfidbrücken aufhebt und somit die Bildung von Proteinaggregaten verhindert. Im letzten Extraktionsansatz wurde gekochtes Hühnereiweiß als Vertretung für prozessierte Lebensmittel mit 20 Puffern extrahiert und im ELISA auf vorhandene Allergene untersucht. Dabei erzielten Extrakte, welche mit Puffern hergestellt wurden, die das kationische Detergens CTAB enthielten, die besten Resultate, wenn der Antikörper gegen Sprüheiweiß verwendet wurde. Die Signalkurve konnte zusätzlich durch Coating der Mikrotiterplatte mit Sprüheiweiß als Standard verbessert werden, welches ebenfalls mit einem CTAB-Puffer anstatt mit PBS extrahiert worden war. Unerwartet zufriedenstellende Ergebnisse lieferte der Antikörper gegen rohes Hühnereiweiß, der trotz seiner Herstellung mittels eines nativen Immunogens in der Lage war, mit SDS-Puffern extrahierte und denaturierte Proteine zu erkennen. Die Antikörper gegen natives und erhitztes Ovomucoid zeigten nur mit TBS und PBS Puffer ohne jeglichen Zusatz von Detergentien passable Signalkurven. Abschließend konnte gezeigt werden, dass der verwendete Extraktionspuffer maßgeblichen Einfluss auf die darauffolgende Analyse der Allergene im ELISA hat und für jeden Antikörper neu optimiert werden muss.
Abstract
(Englisch)
The aim of the diploma thesis is the optimisation of an extraction buffer for egg white allergens from processed food stuff. Additionally, the influence of different buffer components on antigen-antibody binding was determined and a comparison between extracted total protein and signal strength in indirect competitive ELISA was performed. For that purpose four different polyclonal rabbit-antibodies were used, which were produced with spray dried egg white, crude egg white, native and heated ovomucoid. In the first approaches various buffers from literature were compared, which had been used for general protein extraction. The composition of the protein extracts was determined via SDS-PAGE and Western Blot, and the total amount of protein was measured with a commercial BCA-test kit. Afterwards the essential usage of denaturating agents like urea or SDS became evident, which increased the protein yield of the extracts. After ELISA analysis of the extracts a negative effect was observed caused by those denaturing agents. In the case of sodium dodecylsulphate, the inhibiting influence of the anionic detergent on antigen-antibody binding was nearly compensated by adding non-ionic detergents like Brij 35. However, SDS was only suitable as buffer additive for protein extraction, if the detection in ELISA had been performed with the antibodies against spray dried egg white and crude egg white. Moreover it could be noticed, that the reducing agent dithiothreitol is able to facilitate the extraction of ovalbumin and ovomucoid from denatured food samples by removing disulfide bridges and therefore avoiding the formation of protein aggregates. In the last extraction approach cooked egg white, which represents processed food stuff, was extracted with 20 different buffers and analysed in ELISA for accessible allergens. Thereby, extracts which were produced with buffers containing the cationic detergent CTAB, offered the best results if the antibody against spray dried egg white had been used. Furthermore, the signal curve could be optimised by coating the microtiterplate with spray dried egg white as standard, extracted also with a CTAB-buffer instead of the usual PBS. Surprisingly the antibody against crude egg white showed good results in the detection of SDS-extracted and denatured proteins in spite of its production with a native immunogen. A sufficient signal with the antibodies against native and heated ovomucoid was only achieved, if the extraction had been performed with TBS or PBS buffer without any supplements. Finally it could be concluded, that the used extraction buffer influences the subsequent ELISA analysis of the allergens to a large extent and optimisation of the buffer is essential for every new type of antibody.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Egg White allergens extraction food stuff ELISA DTT SDS antigen-antibody reaction
Schlagwörter
(Deutsch)
Eiweißallergene Extraktion Lebensmittel ELISA DTT SDS Antigen-Antikörper Reaktion
Autor*innen
Corinna Kern
Haupttitel (Englisch)
Extraction off egg white allergens from food stuff and determination of the influence of buffer components in indirect competitive ELISA
Paralleltitel (Deutsch)
Extraktion von Eiweißallergenen aus Lebensmittel und Bestimmung der Einflüsse von Pufferkomponenten im indirekten competitiven ELISA
Paralleltitel (Englisch)
Extraction of egg white allergens from food stuff and determination of the influence of buffer components in indirect competitive ELISA
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
VI, 128 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Marcela Hermann
Klassifikationen
35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.45 Immunologie
AC Nummer
AC09024272
Utheses ID
12748
Studienkennzahl
UA | 490 | | |
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