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Extraction off egg white allergens from food stuff and determination of the influence of buffer components in indirect competitive ELISA
Corinna Kern
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Marcela Hermann
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29849.72771.283469-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der Schwerpunkt der vorliegenden Diplomarbeit liegt in der Optimierung eines Puffers zur Extraktion
von Hühnereiweißallergenen aus prozessierten Lebensmitteln. Zusätzlich wurde der Einfluss der
Pufferkomponenten auf die Bindungsreaktion zwischen Antigen und Antikörper untersucht und ein
Vergleich zwischen extrahiertem Gesamtprotein und Signalstärke im indirekten competitive ELISA
erstellt. Dazu wurden vier verschiedene polyklonale Antikörper aus Hasen verwendet, welche mit
Sprüheiweiß, rohem Hühnereiweiß, nativem Ovomucoid und erhitztem Ovomucoid immunisiert wurden.
In den ersten Ansätzen wurden Puffer aus verschiedenen Literaturquellen miteinander verglichen,
welche allgemein zur Proteinextraktion verwendet worden waren. Die Zusammensetzung der
Proteinextrakte wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot bestimmt, und die Gesamtkonzentration an
Protein wurde mit Hilfe eines BCA-Testkits gemessen. Danach wurde der notwendige Einsatz von
denaturierenden Agenzien wie Urea oder SDS ersichtlich, welche den Proteingehalt der Extrakte um ein
Vielfaches steigerten. Nach anschließender Messung der Extrakte im indirekt kompetitiven ELISA,
wurde allerdings ein negativer Effekt der Agenzien festgestellt. Im Falle von Natriumdodecylsulfat
konnte der inhibierende Einfluss des anionischen Detergens auf die Antigen-Antikörper Bindung durch
die Zugabe von nonionische Detergentien (z.B. Brij 35) fast gänzlich aufgehoben werden. Allerdings
eignete sich SDS nur als Pufferzusatz für die Proteinextraktion, wenn die Detektion im ELISA mit den
Antikörpern gegen Sprüheiweiß und gegen rohes Hühnereiweiß erfolgte.
Weiters konnte festgestellt werden, dass Dithiothreitol als Reduktionsmittel die Extraktion von
Ovalbumin und Ovomucoid aus denaturierten Lebensmitteln erleichtert, indem es Disulfidbrücken
aufhebt und somit die Bildung von Proteinaggregaten verhindert.
Im letzten Extraktionsansatz wurde gekochtes Hühnereiweiß als Vertretung für prozessierte
Lebensmittel mit 20 Puffern extrahiert und im ELISA auf vorhandene Allergene untersucht. Dabei
erzielten Extrakte, welche mit Puffern hergestellt wurden, die das kationische Detergens CTAB
enthielten, die besten Resultate, wenn der Antikörper gegen Sprüheiweiß verwendet wurde.
Die Signalkurve konnte zusätzlich durch Coating der Mikrotiterplatte mit Sprüheiweiß als Standard
verbessert werden, welches ebenfalls mit einem CTAB-Puffer anstatt mit PBS extrahiert worden war.
Unerwartet zufriedenstellende Ergebnisse lieferte der Antikörper gegen rohes Hühnereiweiß, der trotz
seiner Herstellung mittels eines nativen Immunogens in der Lage war, mit SDS-Puffern extrahierte und
denaturierte Proteine zu erkennen. Die Antikörper gegen natives und erhitztes Ovomucoid zeigten nur
mit TBS und PBS Puffer ohne jeglichen Zusatz von Detergentien passable Signalkurven. Abschließend
konnte gezeigt werden, dass der verwendete Extraktionspuffer maßgeblichen Einfluss auf die
darauffolgende Analyse der Allergene im ELISA hat und für jeden Antikörper neu optimiert werden
muss.
Abstract
(Englisch)
The aim of the diploma thesis is the optimisation of an extraction buffer for egg white allergens from
processed food stuff. Additionally, the influence of different buffer components on antigen-antibody
binding was determined and a comparison between extracted total protein and signal strength in indirect
competitive ELISA was performed. For that purpose four different polyclonal rabbit-antibodies were
used, which were produced with spray dried egg white, crude egg white, native and heated ovomucoid.
In the first approaches various buffers from literature were compared, which had been used for general
protein extraction. The composition of the protein extracts was determined via SDS-PAGE and Western
Blot, and the total amount of protein was measured with a commercial BCA-test kit. Afterwards the
essential usage of denaturating agents like urea or SDS became evident, which increased the protein
yield of the extracts. After ELISA analysis of the extracts a negative effect was observed caused by
those denaturing agents. In the case of sodium dodecylsulphate, the inhibiting influence of the anionic
detergent on antigen-antibody binding was nearly compensated by adding non-ionic detergents like Brij
35. However, SDS was only suitable as buffer additive for protein extraction, if the detection in ELISA
had been performed with the antibodies against spray dried egg white and crude egg white. Moreover it
could be noticed, that the reducing agent dithiothreitol is able to facilitate the extraction of ovalbumin
and ovomucoid from denatured food samples by removing disulfide bridges and therefore avoiding the
formation of protein aggregates.
In the last extraction approach cooked egg white, which represents processed food stuff, was extracted
with 20 different buffers and analysed in ELISA for accessible allergens. Thereby, extracts which were
produced with buffers containing the cationic detergent CTAB, offered the best results if the antibody
against spray dried egg white had been used.
Furthermore, the signal curve could be optimised by coating the microtiterplate with spray dried egg
white as standard, extracted also with a CTAB-buffer instead of the usual PBS. Surprisingly the
antibody against crude egg white showed good results in the detection of SDS-extracted and denatured
proteins in spite of its production with a native immunogen. A sufficient signal with the antibodies
against native and heated ovomucoid was only achieved, if the extraction had been performed with TBS
or PBS buffer without any supplements. Finally it could be concluded, that the used extraction buffer
influences the subsequent ELISA analysis of the allergens to a large extent and optimisation of the
buffer is essential for every new type of antibody.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Egg White allergens extraction food stuff ELISA DTT SDS antigen-antibody reaction
Schlagwörter
(Deutsch)
Eiweißallergene Extraktion Lebensmittel ELISA DTT SDS Antigen-Antikörper Reaktion
Autor*innen
Corinna Kern
Haupttitel (Englisch)
Extraction off egg white allergens from food stuff and determination of the influence of buffer components in indirect competitive ELISA
Paralleltitel (Deutsch)
Extraktion von Eiweißallergenen aus Lebensmittel und Bestimmung der Einflüsse von Pufferkomponenten im indirekten competitiven ELISA
Paralleltitel (Englisch)
Extraction of egg white allergens from food stuff and determination of the influence of buffer components in indirect competitive ELISA
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
VI, 128 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Marcela Hermann
AC Nummer
AC09024272
Utheses ID
12748
Studienkennzahl
UA | 490 | | |