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Differential proteome analysis of blood-brain barrier (BBB) endothelial in vitro models

Christiane Gebhard

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Christian Noe

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DOI

10.25365/thesis.14316

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30086.38851.679064-3

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Zielsetzung dieser Arbeit ist die Untersuchung von Dysfunktionsstudien an der Blut-Hirn Schranke (BBB) um potentielle „molecules of interest“ zu identifizieren. Durch die Herangehensweise des modernen systempharmakologischen Ansatzes liegt der Focus auf einer systematischen Analyse der „BBB als pharmakologisches drug target“ für in vitro Modellversuche. Modellstudien dienen als Vorstufe um Krankheitsmodelle zu verstehen und diese im weiteren Sinne auf die Situation des Patienten zu rekonstruieren. Die systempharmakologischen Studien dieser Masterarbeit liegen vor allem in der Untersuchung des Proteoms von Blut-Hirn Schranken Endothelzellen und dessen potentieller Veränderungen unter Einfluss verschiedener Kultivierungsbedingungen. Die Experimente wurden jeweils mit humanen Nabelschnur Endothel- (HUVEC) und porcinen Hirnkapillar-Endothel- (PBMEC/C1-2) Zelllinien durchgeführt. Die getesteten Kultivierungsbedingungen wurden in folgende Ansätze unterteilt: Co-Kultur; Induziert und Nicht induziert. Die Systeme Co-Kultur und Induziert beinhalten Faktoren, die Blut-Hirn Schranken Eigenschaften in Endothelzellen induzieren, wodurch sich eine Veränderung der sog. „tight junctions“ innerhalb der Zellen ergibt. Bei dem System Co-Kultur wird die experimentelle Endothelzelllinie gemeinsam mit Astrozyten, welche aus Rattenhirn isoliert wurden, kultiviert. Das System Induziert wird ausschließlich mit der experimentellen Endothelzelllinie durchgeführt, jedoch in einem Astrozyten-konditionierten Kultivierungsmedium (ACM). Mittels kontinuierlichen elektrischen Widerstandsmessungen (TEER) wurde die Zelldichte in den Kultivierungsmodellen bestimmt, um die Ausbildung eines dichten Monolayers zu verifizieren und anschließend die Zellen zu lysieren. Die Proteomanalyse der Zellextrakte erfolgte durch 2-D Gel Elektrophorese und MALDI TOF MS Technik. Anschließend erfolgte eine gezielte Selektion der Proteine von Interesse (POI), welche signifikante Expressionsänderungen aufwiesen. Einige dieser Proteinspots wurden massenspektrometrisch identifiziert, darunter z.B. Heat shock protein 27 (HSP27), Annexin A5, Aldehyddehydrogenase und Catalase. Diese biologisch relevanten Proteine sind „target Moleküle“ bei Neurodegeneration, oxidativen Stress, spielen eine Rolle in Entzündungsprozessen und sind Regulationsfaktoren der endothelialen Homöostase. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind grundlegende Elemente einer pilot Studie und stellen weitere Ausgangspunkte für die fortlaufende Untersuchung von neurodegenerativen Vorgängen sowie weitere Aufklärung von Mechanismen zur Ausbildung von Blut-Hirn-Schranken-Eigenschaften in Endothelzellmodellen dar.

Abstract

(Englisch)

The aim of this work implicates modern system pharmacological studies which is the elucidation of complex physiological and pathological cellular processes and the analysis and identification of molecules of interests. The overall purpose of this study is to observe dysfunction processes of the blood-brain barrier (BBB) which obverse leads to pathological circumstances caused by neurodegeneration. This pilot study focuses on the proteomic analysis of BBB in vitro models, the influence of different cultivation conditions on barrier tightness and the proteomic pattern. Experiments were conducted with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and porcine brain microvascular endothelial cells (PBMEC/C1-2). The in vitro investigations were conducted under three different cultivation conditions to observe changes on the proteome pattern. Both cell lines were cultivated as follows (a) “co-culture system”, (b) “induced system”, (c)“ uninduced system”. The “co-culture system” comprises of the experimental cell lines (PBMEC/C1-2 or HUVEC) and astrocytic glial cells origin from rat brain. The “induced system” consists of enriced medium containing astrocytic factors (ACM) to induce BBB characteristics by changes in tight junctions (TJ). It is known that astrocytic derived soluble factors may induce the expression of BBB properties in endothelial cells in vitro (Janzer and Raff 1987) Using transendothelial electrical resistance (TEER) measurements to verify the tightness of the cellular monolayer in Transwell filter systems. Subsequently, cells were lysed for proteomic analysis with 2D DIGE and MALDI TOF MS. Statistical analyses revealed differentially expressed protein spots. The identification of “molecules of interests” which indicate significantly changes of the proteome pattern inside the different cultivation conditions was performed via mass spectrometry. Examples for identified proteins as heat shock protein 27 (HSP27), annexin A5, aldehyde dehydrogenase and catalase are target molecules for neurodegeneration oxidative stress, play a role in inflammatory processes and are regulation factors of endothelial homeostasis. The results of this pilot study are profound starting points for further dysfunctional research to elucidate the biological mechanisms of the induction BBB characteristics in cell culture models.

Autor*innen

Christiane Gebhard

Haupttitel (Englisch)

Differential proteome analysis of blood-brain barrier (BBB) endothelial in vitro models

Paralleltitel (Englisch)

Differential proteome analysis of blood-brain barrier (BBB) endothelial in vitro models

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

93 S. : Ill.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christian Noe

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC09397056

Utheses ID

12843

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter