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Characterization of putative repressors of the temperate phage φCh1 and analysis of the flagellum operon as a putative receptor of φCh1
Tatjana Svoboda
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.14412
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29168.70761.738864-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
φCh1 ist ein Halophage, der das Archaeon Natrialba magadii befällt, welches unter extremen Bedingungen lebt, wie hohe Salzkonzentrationen und einem hohen pH Wert. Der Halophage ist temperent, was bedeutet, dass er sich in 2 verschiedenen Zyklen vermehren kann, dem lytischen und dem lysogenen Zyklus.
Diese Diplomarbeit hat das Ziel, die Repressoren zu identifizeiren und zu charakterisieren, die für das Verhindern des Eintritts in den lytischen Zyklus verantwortlich sind. Einer dieser Repressoren ist das Genprodukt des ORF49 (gp49). Die Fähigkeit zur Repression der Lyse wurde bereits in vorangegangen Studien verifiziert. In dieser Arbeit wurde der Repressor auf weitere funktionelle Domänen und Wirkmechanismen untersucht. Durch die Etablierung und folgende Analyse einer ORF49 Deletionsmutante konnte der Phänotyp des Funktionsverlusts des gp49 untersucht werden. Dieser zeichnet sich durch stark zunehmende Plaquegröße und schneller voranschreitende Lyse des Wirts Nab. magadii aus. Hiermit konnte ein weiterer Beweis für die regulatorische Wirkung des gp49 erbracht werden. Des Weiteren konnte durch Deletions- und folgende Funktionsanalysen gezeigt werden, dass trotz des Verlusts der N- terminalen DNA Bindungsdomäne die regulatorische Wirkung des gp49 erhalten bleibt. Die Regulation auf DNA Ebene scheint also nicht essentiell zu sein für die Repression durch gp49. Dies könnte auf das Agieren auf RNA Ebene hindeuten oder auf das Agieren außerhalb der Zelle, zum Beispiel das Verhindern des Eindringen der Phagen in den Wirt. Um die Möglichkeit der RNA Regulation auszuschließen, wurde eine AUG Deletion in den ORF49 eingefügt, um dessen Translation zu verhindern. Die ORF49ΔAUG Mutante war nun nicht mehr fähig, die Lyse durch φCH1 zu repremieren. Mittels eines Adsorptionsassays konnte die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass gp49 das Eindringen der Phagen in den Wirt verhindert.
Einen weiteren möglichen Regulator der Lyse stellt gp95 dar. Dieser wurde im Zuge dieser Arbeit auf seine Repressoraktivität überprüft, indem er in Nab. magadii transformiert wurde und der Versuch einer φCh1 Infektion unternommen wurde. Es konnte jedoch kein verändertes Lyseverhalten festgestellt werden. gp95 kann also als Repressor ausgeschlossen werden. Des Weiteren wurde die DNA Bindungsfähigkeit des gp95 mittels EMSA überprüft. Diese konnte nicht verifiziert werden.
Ein weiteres Thema dieser Diplomarbeit ist die Identifizierung der Struktur, an die der Phage bindet um in die Wirtszelle aufgenommen zu werden. Eine mögliche Struktur ist hierbei das Flagellum von Nab. magadii. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurden Archaeen, die normalerweise nicht durch φCh1 infizierbar sind (N. pharaoins und Hbt. salinarum) mit dem Flagellaoperon aus Nab. magadii transformiert um anschließend den Versuch zu unternehmen, sie mit φCh1 zu infizieren. Es konnte jedoch keine Phagen bedingte Lyse durch das Einbringen der Flagellenstrukturen erzielt werden.
Abstract
(Englisch)
φCh1 is a halophage, infecting the archeon Natrialba magadii, facing extreme conditions like high salinity and a high pH. The halophage is temperate, which means, that the phage can replicate in 2 different forms- the lytic and the lysogenic cycle.
The aim of this diploma thesis is to identify and analyse regulatory elements, which influence the switch between lysogenic and lytic life cycle. One of these repressors is the gene product of ORF49 (gp49), whose repressor activity has been determined in previous studies. In this work the repressor was analyzed regarding functional domains and mode of action. With the establishment of the deletion mutation of ORF49 the loss of function could be determined. This phenotype shows an increased size of plaque and an earlier onset of lysis of the host Nab. magadii. This is a further evidence for the regulatory effect of gp49. With the construction of N-terminal deletions and following analysis it was shown that despite the loss of the N-terminal DNA binding domain the regulatory effect of gp49 maintains. The regulation on DNA level seems not to be essential for repression by gp49. This could indicate that gp49 acts on RNA level or that it acts outside the cell by preventing phage adsorption, for example. To analyse a putative acting on RNA level, an AUG deletion was introduced into the ORF49 to prevent translation. The resulting ORF49ΔAUG was not able to repress the lysis of φCh1 anymore. With an adsorption assay the possibility was excepted that gp49 acts outside the cell.
Another putative regulator of lysis is gp95. With the transformation of ORF95 into Nab. magadii and following infection studies with φCh1 it could be determined that gp95 has no influence on lysis regulation of φCh1. Further on it was analysed if gp95 has the ability to bind to DNA. This could not be confirmed.
Another topic of this diploma thesis is to identify the structure, on which the phage binds for identification and adsorption. A possible structure is the flagellum of Nab. magadii. To confirm this assumption Archaea, which can normally not infected with φCh1 like N. pharaoins and Hbt. salinarum were transformed with the flagella operon of Nab. magadii and tried to infect with φCh1. No phage dependend lysis could be observed.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Archaea haloalkalophilic phage temperate repressor flagella φCh1 Natrialba magadii ORF49 ORF95
Schlagwörter
(Deutsch)
Archaea haloalkalophil Phagen temperent Repressor Flagellen φCh1 Natrialba magadii ORF49 ORF95
Autor*innen
Tatjana Svoboda
Haupttitel (Englisch)
Characterization of putative repressors of the temperate phage φCh1 and analysis of the flagellum operon as a putative receptor of φCh1
Paralleltitel (Deutsch)
Charkaterisierung möglicher Repressoren des temperenten Phagen φCh1 und Analyse des Flagellum Operons als möglicher Rezeptor für φCh1
Paralleltitel (Englisch)
Characterization of putative repressors of the temperate phage φCh1 and analysis of the flagellum operon as a putative receptor of φCh1
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
108 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
AC Nummer
AC09400694
Utheses ID
12930
Studienkennzahl
UA | 441 | | |