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The role of the stem region of the fusion protein E in flavivirus membrane fusion
Karen Pangerl
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Franz X. Heinz
DOI
10.25365/thesis.14469
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29475.13130.471860-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Zum Genus der Flaviviren zählen eine Reihe von humanpathogenen Krankheitserregern wie Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, West Nil Virus, Japanische Enzephalitis Virus und Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME) Virus. Flaviviren gelangen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose in die Zelle und der saure pH im Endosom induziert die Fusion von viraler und endosomaler Membran. Dieser Fusionsprozess wird von dem viralen Hüllprotein E, einem Klasse II Fusionsprotein vermittelt, das eine Dimer-Trimer-Umwandlung durchläuft und dabei Energie für die Fusion zur Verfügung stellt. Der externe Teil des E Proteins, der aus 3 Domänen (DI, DII, DIII) zusammengesetzt ist, wird durch eine sogenannte Stamm-Region mit einem Doppel-Transmembrananker verbunden. In derzeitigen Modellen wird vermutet, dass spezifische Interaktionen des Stammes mit der DII des Trimers die treibende Kraft für die späten Phasen der Fusion (also das Verschmelzen der beiden Lipid Bilayer) darstellen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, einen eindeutigen Nachweis für die Bedeutung der Stamm-Trimer-Interaktion zu finden und die Rolle der Stamm-Region in der Membranfusion von Flaviviren zu untersuchen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde diese Fragestellung durch Mutagenese von Rekombinanten Subviralen Partikeln (RSP) des FSME Virus behandelt. Wir mutierten konservierte Reste im Stamm und in möglichen Interaktionsregionen und
analysierten den Einfluss der Mutationen auf verschiedene Schritte des Fusionsprozesses. Am Beispiel mehrerer Stamm-Mutanten konnten wir nachweisen, dass die Stamm-Region für die späten Stadien der Fusion bedeutend ist. Desweiteren war es uns möglich, eine spezifische Interaktion zwischen Stamm und Trimer-Ektodomäne zu identifizieren. Die Mutation (L223I) in DII beeinträchtigte stark die Thermostabilität des Trimers und zugleich die Fusogenität der RSP-Mutante. Dieser negative Effekt konnte durch eine zusätzliche Mutation im Stamm zumindest teilweise kompensiert werden. Im Vergleich zur Einzelmutante wies die Doppelmutante (L223IF403I) verbesserte Trimerstabilität und Fusionsaktivität auf.
Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir diese Interaktion im infektiösen System
und führten die im RSP-System charakterisierten Mutationen in den infektiösen FSME Virus-Klon ein. Überraschenderweise waren beide Virusmutanten (L223I und
L223I-F403I) infektiös, obgleich sie eine Reduktion in ihrer spezifischen Infektiosität
im Vergleich zum Wildtyp aufwiesen. Offensichtlich können Fusionsaktivitäten von
RSP-Mutanten nicht direkt auf das infektiöse System übertragen werden, was in zukünftigen Studien genauer untersucht werden muss. Eine mögliche Erklärung für
diese Diskrepanz könnte die unterschiedliche Geometrie von RSP und Virionen sein.
Während an der Oberfläche von RSP 30 E Proteindimere in einer T=1 Symmetrie organisiert sind, sind an der Oberfläche von Virionen 90 E Proteindimere dicht in einer Fischgräten-ähnlichen Anordnung gepackt. Diese spezielle E Proteinanordnung auf Virionen könnte zusätzliche kooperative Effekte ermöglichen, welche Auswirkungen von Mutationen auf die Virusfusion abschwächen. Darüberhinaus stellten wir fest, dass Mutationen, welche die Sekretion von Partikeln im RSP System verhindern, die Produktion von infektiösen Viren erlauben.
Wir konnten mit dieser Arbeit mechanistische Details über die Rolle der Stamm-Region in der Membranfusion von Flaviviren aufdecken. Wir identifizierten eine spezifische intramolekulare Interaktion zwischen Stamm und DII, welche für die Stabilität der Postfusionsstruktur von großer Bedeutung ist und Membranfusion begünstigt. Das unterschiedliche Ausmaß der Auswirkungen von Mutationen auf RSP und Viren muss in weiterführenden Studien genauer untersucht werden.
Abstract
(Englisch)
Flaviviruses, comprising important human pathogens such as dengue virus, Japanese encephalitis virus, West Nile virus, yellow fever virus and tick-borne encephalitis virus (TBEV), enter cells by receptor-mediated endocytosis and low-pH-induced fusion from within the endosome. Fusion of the viral with the endosomal membrane is mediated by the major envelope protein E, a class II viral fusion protein, which is organized on the virus surface as metastable dimers forming an icosahedral shell. In the course of membrane fusion, the E protein homodimers are irreversibly converted to more stable homotrimers, thereby releasing energy for the fusion process. The external part of E, which is composed of three distinct domains (DI, DII, DIII), is connected to the double transmembrane anchor by a membrane-proximal region, the so-called stem. The current fusion models hypothesize that the stem zippers along the core of the trimer and interacts with the trimeric ectodomain in the postfusion conformation. In this work, we wanted to generate direct experimental evidence for the importance of stem-trimer core interactions and investigate the role of the stem region in flavivirus membrane fusion.
In the first part of the thesis, we addressed this question by mutagenesis of recombinant subviral particles (RSPs) of TBEV. We targeted highly conserved residues in the stem and at possible stem interaction sites in the E protein DII and assessed the effect of these mutations on different stages of membrane fusion. By this approach, we could demonstrate that the stem region is crucial for late stages of the fusion process and contributes to the postfusion trimer stability. Moreover, the substitution of the DII residue L223 by an isoleucine, drastically affected the thermostability of the E protein trimer and RSP fusion activity. This negative effect was partially compensated by additionally replacing the stem residue F403 to an isoleucine. The double mutant L223I-F403I exhibited enhanced trimer stability and fusion activity compared to the single mutant L223I, indicating a specific interaction site between the stem and the trimer core, which is important for the stability of the E protein postfusion conformation and particle fusion.
In the second part of this thesis, we wanted to supplement the data, obtained with
the RSP system, by investigating the effect of these mutations on infectivity in the
infectious virus system. Both mutations (L223I and L223I-F403I) were introduced
into the infectious clone of TBEV strain Neudoerfl. We discovered that both mutant
viruses (L223I and L223I-F403I) were still infectious, although with a reduction in
their specific infectivity in comparison to wild-type virus. Apparently, fusion data
obtained with mutated RSPs cannot be readily extended to the infectious system
and further studies are needed to clarify this point. A possible explanation for this
discrepancy could be the difference in particle geometry. Whereas on RSPs 30 E
protein dimers are organized in a T=1 symmetry, on virions 90 E protein dimers are
more densely packed in a herringbone-like lattice. This special arrangement might
provide cooperative effects on virions, resulting in a less dramatic effect of introduced
mutations on viral fusion. In addition, we could show that mutations, which did not
result in particle secretion in the RSP system, allowed the generation of infectious
virions.
In this work, we were able to reveal mechanistic details on the role of the stem
region in flavivirus fusion, especially through the use of RSPs. We identified an
intramolecular interaction site, which clearly stabilizes the postfusion trimer and
facilitates membrane fusion. The observed discrepancies between RSP and infectious virus system will be investigated in future studies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
flavivirus tick-borne encephalitis virus membrane fusion fusion protein E stem region
Schlagwörter
(Deutsch)
Flaviviren Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus Fusion Fusionsprotein E Stamm-Region
Autor*innen
Karen Pangerl
Haupttitel (Englisch)
The role of the stem region of the fusion protein E in flavivirus membrane fusion
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle der Stamm-Region des Fusionsproteins E im Fusionsmechanismus von Flaviviren
Paralleltitel (Englisch)
The role of the stem region of the fusion protein E in flavivirus membrane fusion
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
95 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Hans-Dieter Klenk ,
Dieter Blaas
Klassifikation
42 Biologie > 42.32 Virologie
AC Nummer
AC09400692
Utheses ID
12976
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |