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Functional and molecular characterization of proteins involved in Mg2+ and K+ homeostasis

Gerhard Sponder

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Kristina Djinovic-Carugo

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DOI

10.25365/thesis.14470

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29432.71606.982669-0

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Transportprozesse durch Zellmembranen sind ein herausforderndes und faszinierendes Forschungsgebiet. Mrs2p und sein bakterielles Homolog CorA gehören zu einer großen Familie von Mg2+ Transportern. Charakteristische Eigenschaften der Mitglieder dieser Familie sind zwei Transmembrandomänen (TMs) im C-terminalen Bereich der Proteine und das hochkonservierte Motiv G-M-N am Ende der TM 1. Um weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen der Regulation dieser Transporter zu bekommen, wurden Mutationsanalysen an Mitgliedern der CorA/MRS2 Familie durchgeführt. Bei CorA von Thermotoga maritima konnte die Schlüsselrolle der Aminosäure Leu294 als Schleuse des Kanals bestätigt werden. Mutationen an dieser Position haben eine starke Auswirkung auf die Fähigkeit des Ionenkanals die Pore zu schließen und sind letal für die Zelle. Im Gegensatz dazu deuten unsere Ergebnisse mit MRS2 darauf hin, dass die Regulation des Ionentransports in den eukaryotischen Vertretern der Familie wesentlich komplexer ist. Wir haben eine vergleichende Strukturanalyse der Kristallstrukturen von T. maritima CorA und der N-terminalen Domäne von Saccharomyces cerevisiae Mrs2p durchgeführt. Es konnten Aminosäuren identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Schließen des Kanals beteiligt sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Met309 in Mrs2p und Leu294 in CorA eine gleichwertige Rolle in der Regulation des Ionenflusses spielen. Mutationen an dieser Position führen aber nicht zu einer vollständigen Deregulierung des Schließmechanismus, wie es bei Leu294 von CorA beobachtet wurde. Eine zweite Schleuse (von Val315 gebildet) wurde ebenfalls identifiziert - scheint aber für die Kontrolle des Ionentransports eine untergeordnete Rolle zu spielen. Durch strukturbasierende Sequenzanalyse konnte auch eine potentielle Kationenbindungsstelle identifiziert werden, die als Messfühler der intramitochondrialen Mg2+ Konzentration fungiert. Die Beteiligung der hochkonservierten Aminosäure Asp97 an der Bildung einer Kationenbindungsstelle konnte experimentell aber nicht eindeutig gezeigt werden. Zusätzlich wurde das hochkonservierte G-M-N Motiv von Mrs2p mittels Zufallsmutagenese analysiert. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass sogar konservative Substitutionen einzelner Aminosäuren in diesem Motiv nicht toleriert werden und die Transportaktivität von CorA und Mrs2p stark minimieren. Eine Serie von Mutanten zeigt aber noch immer Transportaktivität, obwohl die Sequenzen überraschend stark von der Sequenz G-M-N abweichen. Die Selektivität dieser Mutanten für Mg2+ war aber reduziert. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das G-M-N Motiv eine zentrale Rolle für die Substratselektivität der CorA/Mrs2p Familie spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde auch die Funktion von Lpe10p, dem Homolog von Mrs2p in Hefe, genauer untersucht. Die Deletion von LPE10 oder MRS2 führt in beiden Fällen zu einem Wachstumsdefekt auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen. Im Gegensatz zur Deletion von MRS2 führt die Deletion von LPE10 aber zusätzlich zu einer starken Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials. Lpe10p alleine kann keinen Mg2+ selektiven Ionenkanal bilden, es bildet aber Heterooligomere mit Mrs2p, die zu einer Reduktion der Leitfähigkeit des Mrs2p Kanals führen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Interaktion zwischen den beiden Proteinen eine entscheidende Rolle für die mitochondriale Mg2+ Homöostase in S. cerevisiae spielt. Im Vergleich zu Lpe10p oder CorA, besitzt Mrs2p einen ungewöhnlich langen C-Terminus. Wir haben eine ortspezifische Mutagenese am nicht-konservierten, positiv geladenem KRRRK Motiv durchgeführt und eine C-terminale Verkürzung des Mrs2 Proteins hergestellt. Während das KRRRK Motiv selbst keine entscheidende Rolle für die Transportaktivität des Kanals spielt, führt die größere Deletion am C-Terminus zu eine starken Reduktion der Funktionalität des Kanals. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zwei Mitglieder der MDM38/LETM1 Familie aus Hefe charakterisiert. In vorangegangenen Studien wurde Mdm38p bereits als essentieller Faktor im mitochondrialen K+/H+ Austausch in S. cerevisiae beschrieben. In einer genomweiten Suche nach Suppressoren, wurden die Proteine Mrs7p and Ydl183cp als starke Suppressoren der MDM38 Deletion identifiziert. Während Mrs7p eine große Ähnlichkeit zu Mdm38p aufweist, scheint Ydl183c ein nicht verwandtes Protein zu sein. Da beide Proteine vermutlich nur eine Transmembrandomäne besitzen, ist es relativ unwahrscheinlich, dass sie den aktiven K+/H+ Austauscher alleine bilden. Mdm38p/Letm1 und Mrs7p wurden als Teil von Proteinkomplexen mit hohem Molekulargewicht in der inneren Mitochondrienmembran nachgewiesen. Diese Beobachtung lässt darauf schließen, dass diese Proteine Homomultimere formen oder- noch wahrscheinlicher- als Cofaktoren mit dem bisher unbekannten K+/H+ Austauscher assozieren. Um diese Fragestellung zu klären, wurde versucht Interaktionspartner von Mrs7p zu identifizieren, mit der Erwartung den verantwortlichen Antiporter zu finden.

Abstract

(Englisch)

Transport processes across cellular membranes have been a challenging and fascinating field of research for the past 50 years. Mrs2p and its bacterial homolog CorA belong to a large family of Mg2+ transporters. Common characteristics of members of this family are two transmembrane domains (TMs) in the C-terminal part of the protein and the highly conserved G-M-N motif at the end of TM 1. In order to obtain new insights into the molecular mechanisms of regulation of these transporters, mutational analyses on members of the CorA/MRS2 family were performed. For CorA from Thermotoga maritima we confirmed the key gating role of residue Leu294 by forming a mechanical barrier for ion permeation. Mutations at this position strongly affect the ability of the channel to close the ion conduction pathway, which is eventually lethal for the cell. In contrast, our studies on MRS2 suggest that the regulation of Mg2+ transport is more complex in eukaryotic members of this family. We performed a comparative analysis of the crystal structure of T. maritima CorA and the structure of the N-terminal domain of Saccharomyces cerevisiae Mrs2p, including the pore forming TM 1. We thereby identified amino acid residues most likely involved in gating of the channel. Our results show that in Mrs2p, Met309 is the equivalent to Leu294 in CorA and fulfils a similar function in gating the channel. However, mutations at this position do not lead to a complete deregulation of the closing mechanism as observed for Leu294 in CorA. A second gate formed by Val315 was identified but appears to be less important in controlling ion translocation. By structure-based sequence analysis, we identified a potential cation binding site putatively involved in sensing the intramitochondrial Mg2+ concentration. However, our attempts to experimentally demonstrate the involvement of the highly conserved amino acid Asp97 in formation of a cation binding site did not yield a clear result. We also performed a random mutational analysis of the highly conserved G-M-N motif of Mrs2p. It has been shown that even conservative single amino acid substitutions in this motif abolish the transport activity of CorA and Mrs2p. Surprisingly, we identified a series of mutants with sequences completely different from G-M-N, but still able to transport Mg2+. However, these mutants exhibited reduced selectivity for Mg2+. Our results suggest that the G-M-N motif plays a central role for the substrate specificity in the CorA/Mrs2p family. Besides Mrs2p the genome of S. cerevisiae encodes a homologous protein, namely Lpe10p. In this study Lpe10p was investigated in more detail. Deletion of LPE10 or MRS2 similarly leads to impaired growth on non-fermentable carbon sources. However, in contrast to deletion of MRS2, deletion of LPE10 results in a strong reduction of the mitochondrial membrane potential. Lpe10p alone cannot form a Mg2+-selective channel but it is able to hetero-oligomerize with Mrs2p and thereby reduces the conductance of the Mrs2p channel. Our results indicate that the interplay between the two proteins is important to maintain the mitochondrial Mg2+ homeostasis in S. cerevisiae. Compared to Lpe10p or CorA, S. cerevisiae Mrs2p has an exceptionally long C-terminus. We performed site-directed mutagenesis on the non-conserved positively charged KRRRK motif and created a C-terminally truncated version of Mrs2p. While the KRRRK motif does not appear to be crucial for the function, large deletions in the C-terminal part of the protein strongly affect the transport activity of the channel. The second part of this thesis focuses on the biochemical characterization of the two yeast members of the MDM38/LETM1 family. Mdm38p has previously been characterized as an essential factor for mitochondrial K+/H+ exchange in S. cerevisiae. In a genome-wide suppressor screen, the proteins Mrs7p and Ydl183cp were identified as strong suppressors of the MDM38 deletion. While Mrs7p exhibits a high sequence similarity to Mdm38p and Letm1, Ydl183c appears to be an unrelated protein. Since these proteins only have one predicted transmembrane domain, it is unlikely that they form the K+/H+ exchanger. Mdm38p/Letm1 and Mrs7p were found to form high molecular weight complexes in the inner mitochondrial membrane suggesting that they form homo-multimers or rather associate as a cofactor with the so far unidentified K+/H+ exchanger. To tackle this question, we aimed here at identifying the interaction partners of Mrs7p, and expected to find the antiporter among them.

Autor*innen

Gerhard Sponder

Haupttitel (Englisch)

Functional and molecular characterization of proteins involved in Mg2+ and K+ homeostasis

Paralleltitel (Deutsch)

Funktionelle und molekulare Charakterisierung von an der Mg2+ und K+ Homöostase beteiligten Proteinen

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

172 S., Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Federica Wolf ,

Volker Knoop

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC09404949

Utheses ID

12977

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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