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Characterization of the c11orf51 subunit of the Anaphase-Promoting Complex / Cyclosome
Hannelore Schutz
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Jan-Michael Peters
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DOI
10.25365/thesis.14738
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29708.06773.247353-3
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Das Durchlaufen des Zellzyklus hängt vom Abbau bestimmter regulatorischer Proteine ab, zu denen Securin und mitotische Cycline zählen. Diese Abbaureaktionen werden von der E3 Ubiquitin-Ligase Anaphase-Promoting Complex / Cyclosom (APC/C) eingeleitet, welche selbst zellzyklisch reguliert wird. Der APC/C ist ein 1.5 MDa großer Proteinkomplex, welcher bei Vertebraten aus mindestens 13 Untereinheiten aufgebaut ist, und er fügt Ubiquitin-Ketten an Substratproteine an. Proteine, die mehrerer solcher Ubiquitin-Moleküle besitzen, werden vom 26S proteasome erkannt und proteolytisch abgebaut. Dieser unwiederrufliche Vorgang versichert, dass der Zellzyklus unidirektional verläuft und dass das nächste Stadium im Zellzyklus gesichert stattfinden kann. Da dieser Prozess ein „alles-oder-nichts“-Vorgang ist, muss diese Ubiquitylierungsreaktion sehr gut reguliert werden und sie muss zellzyklus-abhängig stattfinden. Das wiederrum bedeutet, dass die Aktivität des APC/C´s stark kontrolliert werden muss. Dies wird durch mehrere Faktoren gewährleistet. Dazu gehören Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsvorgänge, das transiente Binden der APC/C-spezifischen aktivatorischen Proteine Cdc20 und Cdh1, sowie die Interaktion mit inhibitorischen Proteinen wie etwa dem mitotic checkpoint complex (MCC). Obwohl der APC/C schon seit mehr als einem Jahrzehnt intensiv erforscht wird , wissen wir immer noch wenig über die Regulation dieses Komplexes während des Zellzyklus und für viele seiner Untereinheiten sind die biochemischen Funktionen und Eigenschaften weitestgehend unbekannt. Erst kürzlich wurde gezeigt, der Genabschnitt C11ORF51 (chromosome 11 open reading frame 51) für ein Protein kodiert, welches für den Zellzyklusprozess von Bedeutung ist. Zudem fand man heraus, dass es mit humanem APC/C assoziert. Dies wurde in Proteinaufreingungsexperimenten gezeigt, bei denen APC/C Untereinheiten als „bait“ benutzt wurden. Wir beschlossen, das c11orf51 Protein näher zu charakterisieren und seine biologische Funktion zu analysieren. Dabei haben wir eine Kombination aus biochemischen und (quantitativ-) massenspektrometrischer Methoden angewandt. Das Protein c11orf51 wurde in unseren Untersuchungen als eine neue Untereinheit des humanen APC/C´s identifizieren und seine biochemischen Eigenschaften wurden bestimmt. In biochemischen Experimenten, teilweise in Kombination mit Massespektrometrie, konnte ich zeigen, dass c11orf51 während des gesamten Zellzyklus mit dem APC/C interagiert. Des Weiteren ist zelluläres c11orf51 zum größten Teil an den Komplex gebunden und die mit c11orf51-assozierte Form des APC/C´s ist aktiv gegenüber dem Substratprotein cyclin B1, wie in vitro Ubiquitylierungsassays zeigen. Mit Hilfe der Antikörper-Markierungsmethode, bei welchem wir c11orf51-spezifische Peptidantikörper verwendeten, konnten wir in negative staining-elektronenmikroskopischen Studien die Bildung von APC/C-Dimeren beobachten. Dies weist darauf hin, dass c11orf51 ein Protein ist das fest mit dem APC/C assoziert. Deletion von c11orf51 durch RNA-Interferenz ergab einen Phänotyp in sich teilenden humanen Zellen in Kultur. Dabei war die Zeit, welche die Zellen in der Metaphase verbrachten, im Vergleich zu kontroll-transfizierten Zellen signifikant verlängert. Um weiter zu bestätigen, dass c11orf51 eine konstitutive APC/C-Untereinheit ist, wurde eine quantitative Proteomanalyse angewandt. Dabei arretierte ich humane HeLa Zellen in verschiedenen Zellzyklus-Stadien und reinigte den APC/C auf, welcher weiteres mit dem iTRAQ Reagenz chemisch markiert und anschließend mit quantitativer Massenspektrometrie analysiert wurde. Zusätzlich wurden noch weitere APC/C-Bindungsproteins quantifiziert, wie etwa die Co-Aktivatoren. Diese Methode kann zukünftig dazu dienen, eine zusammenfassende Studie über die Zusammensetzung des APC/C´s während des Zellzykluses zu erhalten.
Abstract
(Englisch)
Cell cycle progression depends on the degradation of specific regulatory proteins, such as securin and mitotic cyclins. Degradation of these proteins is initiated by the cell cycle-regulated activity of the E3 ubiquitin ligase anaphase-promoting complex / cyclosome (APC/C). The APC/C is a 1.5 MDa protein complex, composed of 13 individual subunits, which assembles ubiquitin chains on substrate proteins. Polyubiquitylation targets these proteins for recognition by the 26S proteasome, resulting in their subsequent degradation. This pathway ensures unidirectionality of the cell cycle process and forces full commitment to progress to the next stage. Because this process is an “all-or-nothing”-event, substrate ubiquitylation has to be highly regulated in a cell cycle-specific manner. Hence, APC/C activity has to be tightly controlled. This is ensured by different events, such as phosphorylation and dephosphorylation, transient binding of its co-activatory subunits Cdc20 and Cdh1 as well as on association of inhibitory proteins, like the mitotic checkpoint complex (MCC). Even though the APC/C has been subjected to intensive studies for more than a decade now, we still know little about APC/C regulation during the cell cycle and what the function of its many subunits are. Moreover, despite of APC/C´s large size it seems as if there are more associating proteins waiting to be discovered. Only recently, a protein encoded by C11ORF51 (chromosome 11 open reading frame 51) was shown to be required for correct cell cycle progression. Moreover, it was found to associate with human APC/C after tandem affinity purification using tagged APC/C subunits as bait. We aimed to characterize the c11orf51 protein further and to analyze its biological function. Therefore, we applied a combinatorial approach of biochemical and quantitative mass spectrometric analysis which allowed us to comprehensively look at human APC/C composition during the cell cycle. We could identify the c11orf51 protein as a constitutive APC/C subunit and characterized its biochemical properties. In different biochemical assays, partially combined with mass spectrometry, I could show that c11orf51 protein associates with the APC/C during the entire cell cycle, which identifies the c11orf51 protein as a novel and constitutive subunit of human APC/C. In vitro ubiquitylation assays revealed that the APC/C containing c11orf51 protein is active towards its mitotic substrate cyclin B1. Antibody-labelling using c11orf51 peptide specific antibodies resulted in APC/C-Dimer formation in negative staining electronmicroscopy studies, which confirms that c11orf51 must tightly bind to the complex. Depletion of the c11orf51 protein by RNA interference (RNAi) resulted in a metaphase arrest phenotype in proliferating human cultured cells as analyzed by immunofluorescence microscopy on fixed cells. Furthermore, live cell imaging experiments indicated that the time from nuclear envelope breakdown (NEBD) to anaphase onset was significantly prolonged, as compared to mock-transfected cells. To further verify that c11orf51 protein is a constitutive APC/C subunit, we applied a quantitative proteomics approach. To this end, immunopurified APC/C from human cultured cells that had been arrested at different cell cycle stages were used for iTRAQ labeling and quantitative mass spectrometry. This approach allowed us to resolve the composition of human APC/C during the cell cycle. We could show that the protein levels of APC/C-associated c11orf51 did not significantly fluctuate during the cell cycle, which confirms that c11orf51p is a bona fide subunit of human APC/C.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Anaphase-Promoting Complex Cyclosome regulation c11orf51 Mnd2 homologue mitotic checkpoint complex MCC
Schlagwörter
(Deutsch)
Anaphase-Promoting Complex Cyclosome Regulierung c11orf51 Mnd2 Homolog Mitotischer Checkpoint Complex MCC
Autor*innen
Hannelore Schutz
Haupttitel (Englisch)
Characterization of the c11orf51 subunit of the Anaphase-Promoting Complex / Cyclosome
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
146 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Jan-Michael Peters
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC09415436
Utheses ID
13221
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1