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The mitochondrial K+/H+ exchanger

identification and characterization of novel components

Markus Aleschko

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Kristina Djinovic-Carugo

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DOI

10.25365/thesis.14825

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30154.24623.402759-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Mitochondrien sind von einer Doppelmembran umschlossene Organellen, die verschiedene essentielle Zellprozesse kontrollieren, wie etwa ATP-Produktion, Apoptose, Ionenhomöostase, Volumenkontrolle und viele weitere Stoffwechselwege. Um diese Funktionen zu erfüllen, erzeugen Mitochondrien ein Membranpotential (Dy) an der inneren Membran. Aufgrund des Ausstoßes von H+ durch Redoxpumpen der Elektronentransportkette, wird dieses Membranpotential, welches innen negative ist, aufrecht erhalten. In Anwesenheit von hohen Mengen an K+ und anderen zellulären Kationen wie Na+ und Li+, bewirkt das innen negative Dy einen starken Ioneneinstrom. Um die mitochondriale Ionenhomöostase und Osmolarität aufrecht zu erhalten, muß diesem Ionenüberschuss mittels Kationen/Protonen Austauschern entgegengewirkt werden, wie es von Nobelpreisträger Peter Mitchell vor einem halben Jahrhundert vorgeschlagen wurde. Bisherige Daten konnten eindeutig zeigen, dass die Mdm38p/Letm1 Familie - Proteine der inneren Mitochondrienmembran mit einer Transmembranhelix - für den mitochondrialen K+/H+ Austausch essentiell ist. Die Deletion des MDM38 Gens in der Hefe führt zu schwerwiegendem atmungsdefekten Wachstum, mitochondrialer K+ Überladung, fast vollständig fehlender K+/H+ Austausch-Aktivität, Depolarisation der Mitochondrienmembran, sowie starker Schwellung und Fragmentierung des mitochondrialen Netzwerkes. Obwohl eine tragende Funktion von MDM38 in der Kontrolle des mitochondrialen K+/H+ Austausches nicht bezweifelt werden kann, ist die molekulare Identität des eigentlichen Austauschers weiterhin unbekannt. In diesem Forschungsprojekt konzentrierten wir uns auf die Charakterisierung von Proteinen, welche im mitochondrialen Kationen/Protonen Austausch involviert sind, mit dem letztendlichen Ziel der Identifizierung des tatsächlichen mitochondrialen K+/H+ Austauschers. In einer genomweiten Suche nach Überexpressions-Suppressoren der mdm38∆ Mutante identifizierten wir Mrs7p, ein Mdm38p homologes Protein, sowie das nicht verwandte Protein Ydl183cp, als starke Suppressoren des beeinträchtigten mitochondrialen K+/H+ Austausches. Dreifach deletierte Mutanten besaßen keinerlei K+/H+ Austausch-Aktivität und zeigten reduzierte zelluläre Lebensfähigkeit sowie autophagischen Abbau defekter Mitochondrien. Desweiteren sind Mdm38p und beide Suppressoren Komponenten von hochmolekularen Proteinkomplexen. Demzufolge entwickelten wir eine Arbeitshypothese, basierend auf der Idee, dass Mdm38p als ein Hilfsprotein direkt mit dem unbekannten K+/H+ Austauscher interagiert. Durch biochemische Analysen mithilfe von Affinitätschromatographie identifizierten wir mögliche Interaktionspartner von Mdm38p: das essentielle mitochondriale Chaperonprotein Ssc1p und das Ergosterol biosynthetische Enzym Erg5p. Hingegen gelang es uns nicht ein Protein mit mehreren Transmembranhelices zu identifizieren, was einem erwarteten Merkmal eines K+/H+ Austauschers entsprechen würde. Nichtsdestotrotz legen unsere Resultate einen engen Zusammenhang zwischen der Membransterol-Zusammensetzung, mitochondrialer Ionenhomöstase, Membranfusion und zellulärer Lebensfähigkeit nahe. Entgegen unserer ursprünglichen Annahme, sprechen die hier gezeigten Daten stark dafür, dass Mdm38p selbst den gesuchten Austauscher darstellt. Dies wäre der erste bekannte Austauscher mit nur einer Transmembranhelix. In einem zweiten Ansatz führten wir eine genomweite synthetisch-genetische Analyse der mdm38∆ Mutante durch. Dabei identifizierten wir sechs Suppressormutanten, die das atmungsabhängige Wachstum und die mitochondriale Morphologie in der Doppelmutante wiederherstellten. Momentan können wir nur darüber spekulieren wie diese Suppressoren, welche in verschiedenen zellulären Funktionen – von transkriptioneller Regulation bis zu zytoskelettaler Organisation – involviert sind, den Wachstums- und Morphologie-Phänotyp wiederherstellen. Basierend auf diesen Erkenntnissen liegen spannende Experimente vor uns.

Abstract

(Englisch)

Mitochondria are double membrane-bound organelles controlling several essential cellular processes like ATP production, apoptosis, ion homeostasis, volume control, and many other metabolic pathways. To fulfill these functions, mitochondria establish an inside negative membrane potential (Dy) across the inner membrane, which is maintained by the ejection of H+ by redox pumps of the electron transport chain. In presence of high abundance of K+ and other cellular cations like Na+ and Li+, the inside negative Dy is a strong driving force for an inwardly directed ion flux. To maintain mitochondrial ion homeostasis and osmolarity, excess cation fluxes have to be counteracted by cation/proton antiporters, as proposed half a century ago by Nobel laureate Peter Mitchell. Solid data showed that the Mdm38p/Letm1 family of single membrane spanning, inner mitochondrial membrane proteins is essential for mitochondrial K+/H+ exchange. Deletion of yeast MDM38 results in a severe respiratory growth defect, mitochondrial K+ overload, almost abolished mitochondrial K+/H+ exchange activities, depolarization of the mitochondrial membrane, drastic mitochondrial swelling, and fragmentation of the mitochondrial reticulum. Though a role of MDM38 in controlling mitochondrial K+/H+ exchange is undoubted, the molecular identity of the exchanger per se still remains elusive. In this research project we focused on the characterization of proteins involved in mitochondrial cation/proton exchange, ultimately aiming at the identification of the actual mitochondrial K+/H+ exchanger. In a genome-wide screen for multicopy suppressors of the mdm38∆ mutant, we identified the Mdm38p homolog Mrs7p and the unrelated Ydl183cp as strong suppressors of impaired mitochondrial K+/H+ exchange. Triple deletion mutants exhibited completely abolished K+/H+ exchange, reduced cellular viability, and autophagic degradation of defective mitochondria. Moreover, both suppressors and Mdm38p were shown to be components of high molecular weight protein complexes. Accordingly, we established a working hypothesis based on the idea of Mdm38p functioning as an auxiliary protein directly interacting with the unknown K+/H+ exchanger. By biochemical analyses based on affinity chromatography, we identified the putative interaction partners of Mdm38p: the essential mitochondrial chaperon Ssc1p and the ergosterol biosynthetic enzyme Erg5p. However, we failed to identify a protein with several transmembrane helices as expected features for the K+/H+ exchanger. Nevertheless, we provide strong evidence for a direct link between membrane sterol composition, mitochondrial ion homeostasis, membrane fusion, and cellular viability. Contrary to our initial consideration, data presented here strongly suggest that Mdm38p itself may represent the exchanger. This would be the first known exchanger containing a single membrane spanning helix. In a second approach, we performed a genome-wide synthetic genetic array analysis of the mdm38∆ mutant, and identified six suppressor mutants restoring respiratory growth and mitochondrial morphology in the double mutant. Currently we can only speculate how these suppressors, with various cellular functions in transcriptional regulation or cytoskeletal organization, may restore the growth and morphology phenotype. Based on these findings there are exciting experiments ahead.

Autor*innen

Markus Aleschko

Haupttitel (Englisch)

The mitochondrial K+/H+ exchanger

Hauptuntertitel (Englisch)

identification and characterization of novel components

Paralleltitel (Deutsch)

Der mitochondriale K+/H+ Austauscher: Identifikation und Charakterisierung neuer Komponenten

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

132 S. : Ill. graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Martin Kolisek ,

Hana Sychrová

Klassifikationen

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.20 Genetik ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC08791396

Utheses ID

13303

Studienkennzahl

UA | 091 | 441 | |

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