Detailansicht
The role of Ca2+ dependent protein kinase 3 in Arabidopsis thaliana during salt stress acclimation
Bernhard Wurzinger
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Markus Teige
DOI
10.25365/thesis.14835
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29523.70706.369155-4
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Pflanzen müssen sich an ständig ändernde Umweltverhältnisse anpassen um erfolgreich wachsen zu können. Viele Umwelteinflüsse wie zum Beispiel Salzstress, Trockenstress oder durch Pathogene hervorgerufener Stress führen zu spezifischen Änderungen in der intrazellulären Konzentration freier Ca2+ Ionen. Verschiedene "Kalziumsensoren" dekodieren diese Kalziumsignale entweder durch post-translationale Modifikation von Enzymen oder führen zur Änderung des Transkriptionsmusters der einzelnen Pflanzenzellen, was schließlich eine physiologische Anpassung der ganzen Pflanze an die geänderten Umweltbedingungen zur Folge hat. Kalzium abhängige Proteinkinasen (CPKs) sind eine Gruppe von Proteinkinasen die durch Bindung von Ca2+ Ionen aktiviert werden. Die bisherigen Daten aus Genomsequenzierungen legen nahe, dass CPKs nur in Genomen von Pflanzen und einigen Protozoen kodiert sind. Für einzelne CPKs konnte durch reverse Genetik eine Rolle in der abiotischen oder in der biotischen Stressantwort nachgewiesen werden. Zum Beginn dieser Dissertation war jedoch wenig über spezifische Substrate und die Regulation jener durch CPKs bekannt.
Ziel dieser Arbeit war es A.thaliana CPK3 eine physiologische Funktion zuzuordnen und etwaige Substrate von AtCPK3 zu identifizieren.
Verschiedene cpk3 knock out, Überexpressor und wild Typ Allele wurden unter unter-schiedlichen Wachstumsbedingungen getestet. Es wurde beobachtet dass die CPK3 Proteinkonzentration positiv mit der Keimungsrate von A.thaliana Samen unter Salzstress-bedingungen korreliert was zur Annahme führte, dass CPK3 eine Rolle in der Akklimatisierung von A.thaliana an Salzstress zu tun hat.
In Experimenten, wie zum Beispiel in vivo Crosslinking und Kinase Essays mit rekombinanter CPK3 und mikrosomalen Membranfraktionen wurden "global" Substrate von CPK3 identifiziert. Parallel dazu wurden potentielle Substrate von CPK3 die zuvor in in vitro Experimenten identifiziert wurden auch in in vivo Interaktionsessays getestet. Des Weiteren konnte gezeigt mit Hilfe von BIFC werden, dass TPK1, ein vakuolärer Kalium Kanal, spezifisch mit CPK3 in vivo interagiert, und das für die Interaktion zwei positiv geladene Arginine neben der regulatorischen 14-3-3 Konsensussequenz von TPK1 wichtig sind. Biochemische Fraktionierung der subzellulären Kompartimente einer Pflanzenzelle und der anschließende Nachweis von CPK3 ergab, dass ein Teil des CPK3 Proteins in Blättern an der vakuolären Membrane assoziiert ist. Zusätzlich verhielten sich die entsprechenden cpk3 und tpk1 Mutanten in Keimungsessays unter Salzstress ähnlich. Berücksichtigt man außerdem, dass die Bindung von 14-3-3 Proteinen an die phosphorylierte 14-3-3 Konsensussequenz von TPK1 zu einer Aktivierung des Kaliumkanals führt (Dirk Becker, Universität Würzburg), erlauben es die Daten ein Model zu erstellen, welches die Rolle von CPK3 in der Akklimatisierung an Salzstress durch Regulation der intrazellulären Ionenhomöostase beschreibt.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass CPK3 spezifisch mit der Nitratreduktase aus A.thaliana interagiert. Ähnlich wie im Fall der Interaktion zwischen CPK3 und TPK1, stabilisieren auch zwei positiv geladene Lysine die Interaktion zwischen CPK3 und TPK1. Ein Vergleich aller Nitratreduktasesequenzen in 22 unterschiedlichen Pflanzenspezies ergab dass 14-3-3 Konsensussequenzen, welche zur posttraslationalen Regulation durch 14-3-3 Proteine nötig sind, nur in Nitratreduktasesequenzen der Gefäß pflanzen vorhanden sind.
Zusätzlich wurden noch in einem neuen Ansatz, welcher In-gel Kinaseessays mit Massen-spektrometrie zur Identifikation von Proteinen verbindet, die Proteinkinase AKIN10/11 und CK2 (Casein Kinase 2) als Interaktionspartner des Transkriptionsfaktors AtbZIP63 identifiziert werden. Diese Interaktionen konnten ebenfalls in vivo in BIFC-Essays bestätigt werden.
Abstract
(Englisch)
In order to successfully grow, plants have to adapt to their continuously changing environment. Many of these environmental stimuli like salt and drought stress or pathogen attack, lead to distinct Ca2+ signals in the plant cell. So called "Ca2+ sensors" are then involved in translating these Ca2+ signals into a physiological response by either directly or indirectly changing the transcriptional state of the cell, or regulating enzymes on a post translational level. CPKs (calcium dependent protein kinases), which were found to be present in plants and some protozoa only, are one versatile group of Ca2+ activated protein kinases acting as Ca2+ sensors. Through reverse genetic experiments CPKs were found to be involved in abiotic as well as in biotic stress signalling. However, at the time starting this thesis, little was known about specific substrates for CPKs and the physiological consequences of regulation of these substrates by CPKs.
The aim of this thesis was to determine a physiological function of AtCPK3 and identify specific substrates of AtCPK3 in A.thaliana.
In screens, testing cpk3 knock out, cpk3 over expresser and wild type plants under different growth conditions, a positive correlation between CPK3 protein amount and the germination rate of the respective seeds was observed, indicating that CPK3 is involved in acclimation to salt stress.
In different unbiased approaches, like in vivo cross-linking or kinase assays on total membrane fractions, targets of CPK3 were identified. In parallel potential targets of CPK3, which had been identified earlier in in vitro assays, were tested for specificity in in vivo interaction assays. For TPK1, a vacuolar K+ channel, specific interaction with CPK3 via two positively charged arginines adjacent to the regulatory 14-3-3 consensus site of TPK1 was determined in quantitative BIFC assays. In biochemical fractionation assays, a fraction of endogenous CPK3 was found to localize at the vacuolar membrane. Similar phenotypes between tpk1 and cpk3 mutant lines were observed in germination assays under salt stress. Together with the observation that binding of 14-3-3 proteins to the phosphorylated 14-3-3 consensus sequence of TPK1 activates the K+ channel (Dirk Becker, University of Würzburg), these data indicate a role of CPK3 in regulating the cellular ion homeostasis, which can, explain the role of CPK3 in salt stress acclimation.
Furthermore CPK3 was demonstrated to specifically interact with nitrate reductase, in a similar way as with TPK1. The two positively charged lysines adjacent to the regulatory 14-3-3 site of nitrate reductase were found to stabilise the interaction between CPK3 and nitrate reductase. Comparison of nitrate reductase sequences revealed that regulation of nitrate reductase by 14-3-3 proteins binding to phosphorylated 14-3-3 consensus sequences seems to be restricted to vascular plants.
In addition, the protein kinases AKIN10/11 and CK2 (casein kinase 2) were identified as the kinases phosphorylating the transcription factor AtbZIP63 in a novel approach combining in-gel kinase assays with mass spectrometry for protein identification. Interaction between the kinases and AtbZIP63 was furthermore confirmed in vivo, using BIFC and yeast two hybrid assays.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
calcium dependent protein kinase (CPK) Arabidopsis thaliana salt stress nitrate reductase protein-protein interaction AKIN10 TPK1
Schlagwörter
(Deutsch)
kalziumabhängige Proteinkinase Arabidopsis thaliana Salzstress Nitratreduktase Protein-Protein Interaktion AKIN10 TPK1
Autor*innen
Bernhard Wurzinger
Haupttitel (Englisch)
The role of Ca2+ dependent protein kinase 3 in Arabidopsis thaliana during salt stress acclimation
Paralleltitel (Deutsch)
Die Bedeutung der Ca2+ abhängigen Proteinkinase 3 in Arabidopsis thaliana während der Salzstressakklimatisierung
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
96 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Wolfram Weckwerth ,
Marc Knight
AC Nummer
AC09004769
Utheses ID
13313
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |