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Process, development for industrial scale bacterial ghost production

Timo Langemann

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Werner Lubitz

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30395.33464.963963-7

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Diese Doktorarbeit ’Prozessentwicklung zur Herstellung von Bacterial Ghosts im Industriemaßstab’ beschreibt die Entwicklung eines Produktionsprozesses für BGs von einem Prozess mit niedriger Zellausbeute in komplexem Medium bis hin zu einem Fed-batch Prozess in einem Minimalmedium. Gezielte Veränderung in den Fermentations- und Ernte- Prozeduren ermöglichten es, höhere Ausbeuten zu erzielen und gleichzeitig die Produktqualität zu steigern. Zudem wurden Parameter zur Echtzeit-Bewertung der Prozessleistung eingeführt, die die Produktion effektiver machen. In einem ersten Schritt wurde ein Prozess mit niedriger Zellausbeute für Shigella flexneri 2a vorgestellt. Dieser Prozess kombiniert die E-Lyse mit der Verwendung von Staphylokokken Nuclease A (SNUC). Letztere ermöglichte eine erweiterte Herabsetzung der Viabilität und zudem den Abbau von DNA im Produkt. In einer Konsistenzstudie aus fünf unter identischen Bedingungen durchgeführten Fermentationen wurde eine mittlere E-Lyseeffizienz von 99.94% erreicht. Nach 90 min E-Lyse und weiteren 180 min SNUC-Aktivität war die Viabilität um beinahe sechs Zehnerpotenzen abgesunken. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der DNA Gehalt des Produkt bis zum Detektionslimit der real-time PCR reduziert werden konnte. Das bedeutet, dass das Produkt im wesentlichen als DNA-frei einzuordnen ist. Chemische Inaktivierung mit 0.75‰ (v/vf) beta-Propiolacton vor der Produkternte durch einen Separator lieferte ein keimfreies Produkt, was durch Sterilitäts-Tests vor und nach der Gefriertrocknung belegt wurde. In der Ernteprozedur für BG-Produkte wurde in der Folge die mechanischen Separation durch Querstromfiltration (TFF) ersetzt. Die Kulturbrühe von Sf2a BG Fermentationen mit niedriger Zellausbeute (≤ 1.0E+09 Zellen pro ml) wurden vor dem Inaktivierungsschritt zehnfach aufkonzentriert, dabei wurde die absolute Menge an freier DNA in der Suspension um 90% reduziert. Rasterexperimente mit Sf2a zeigten, dass die Menge an benötigtem BPL durch diese Maßnahme ebenfalls um den Faktor zehn auf nurmehr 0.075‰ (v/vf) reduziert werden konnte. Diese Ergebnisse wurden für BGs auf Fermentationen mit Escherichia coli bestätigt. Die Anwendungstemperatur entsprach jeweils der Temeratur zur Induktion der E-Lyse: 44°C für Sf2a und 42°C für E. coli. Die Einbindung eines Diafiltrationsschrittes in die E-Lyse Phase bei Fermentationen von E. coli Nissle (EcN) BGs mit mittleren Zelldichten (≤ 1.0E+10 Zellen pro ml) führte zu einer DNA-Abreicherung von mindestens 30% noch vor der Aufkonzentrierung der Kulturbrühe. Dies spiegelte sich direkt im BPL-Bedarf wider, der nur 0.50‰ (v/vf) betrug. So konnte gezeigt werden, dass die benötigte Menge an BPL aus der Zelldichte berechnet werden kann, solange die verbleibende Menge an freier DNA zuverlässig abgeschätz werden kann. Eine Methode zur Beurteilung von E-Lyse Prozessen mittels Durchflusszytometrie (FCM) wurde vorgestellt. Ausgehend von einer existierenden Methode wurde ein verbessertes Assay etabliert. Die größere Durchsichtigkeit der Zellhüllen nach der E-Lyse verändert die Lichtstreuung im vergleich zu vollen Zellen, kombiniert man diese Eigenschaft mit einem geeigneten lebend/tot-Fluoreszenzfarbstoff wie DiBAC4(3) zur Erfassung der Zellviabilität, so lassen sich lebende Zellen, volle aber tote Zellen und leere BGs gut unterscheiden. Die zusätzliche Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs RH414 zur Markierung von Zellmembranen verbesserte die Qualität der FCM Daten wesentlich, da nicht-zelluläres Rauschen effektiv unterdrückt werden konnte. Die Methode liefert quantitativ hochwertige Daten und eignet sie sich daher als Parameter zur Beurteilung von BG Produktionsprozessen in Echtzeit. Durch die Verwendung eines definierte Mediums zur Herstellung von E. coli Nissle 1917 BGs konnte die Produktivität des Batch-Prozesses im Vergleich zu den Fermentationen mit niedrigen Zellausbeuten um den Faktor 10 gesteigert werden (mittlere Zelldichten), ohne dass die E-Lyseeffizienz abnahm. Eine gute Übereinstimmung zwischen Zellzahlbestimmungen durch FCM und herkömmlich ermittelten Zellzahlen mit der Methode der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) wurde gezeigt. Bei der Fermentation mit mittleren Zelldichten war die Anwendung von Querstromfiltration von großem Wert. Da durch das Ausstoßen des Zytoplasma bei höheren Zelldichten die Viskosität des Medium ansteigt, kam es zu verstärkter Schaumbildung. Das Einbinden eines ersten Diaflitrationsschrittes in die E-Lyse Phase half, diesem Effekt entgegen zu wirken und bewirkte als Nebeneffekt auch die bereits erwähnte Abreicherung freier DNA aus der Kulturbrühe. Die gute Konsistenz des Batch-Prozesses wurde in insgesamt neun Läufen gezeigt. Die durchschnittliche Zelldichte vor der E-Lyse war 7.35E+09 Zellen pro ml, die mittlere E-Lyseeffizienz lag bei 99.78%. Die Produktinaktivierung mit 0.50‰ (v/vf) BPL war in allen Fällen ausreichend und lieferte ein keimfreies Produkt nach der Gefriertrocknung. Zusätzlich wurde ein Hochdichte Fed-batch Prozess in einem Minimalmedium vorgestellt. Erste Versuche zeigten, dass es möglich ist, die Zelldichten im Vergleich zum beschriebenen Batch-Prozess mindestens nochmals um den Faktor 10 zu erhöhen (durchschnittliche Zellausbeute vor E-Lyse: 7.06E+10 Zellen pro ml). Es wurde nachgewiesen, dass nach der E-Lyse Induktion eine weiterlaufende, wenn auch exponentiell abnehmende Zufütterungs- Strategie notwendig ist. Bei geeigneter Zufütterung lassen sich E-Lyseeffizienzen > 99.8% erreichen.

Abstract

(Englisch)

This thesis ’Process Development for Industrial Scale Bacterial Ghost Production’ describes the development of a Bacterial Ghost (BG) production process from a low density batch process in complex medium towards a high density fed-batch approach in minimal medium. Specific changes in the fermentation and harvesting procedures allowed to reach higher yields while at the same time product quality was improved. Real-time parameters for the evaluation of process performance were introduced to make the production more efficient. In a first step a stable low density production process for Shigella flexneri 2a (Sf2a) BGs was presented. This process combined the features of E-lysis and staphylococcal nuclease A (SNUC). The latter effected enhanced reduction of viability and moreover significant degradation of DNA in the product. In a consistency study of five production runs performed under identical conditions a mean E-lysis efficiency of 99.94% was obtained. After 90 min of E-lysis and another 180 min of SNUC activity the viability of the cultures was overall reduced by an average of almost six decimal powers. Furthermore, it could be shown that the DNA contents in the product was reduced to the detection limit of real-time PCR by the nuclease indicating the product was essentially DNA-free. Chemical inactivation with 0.75‰ (v/vf) beta-propiolactone (BPL) before harvesting by mechanical separation yielded a bioburden-free product which was verified by sterility tests before and after lyophilization. The harvesting procedure for BG production was changed from mechanical separation to tangential flow filtration (TFF). The culture broth of low density Sf2a BG fermentations (cell densities ≤ 1.0E+09 cells per ml) was concentrated by a factor 10 before inactivation thereby reducing the total amount of free DNA in the suspension by 90%. Screening experiments with Sf2a indicated that by this measure the required amount of BPL could also be reduced by 90% to now 0.075‰ (v/vf). Results were confirmed for low density fermentations of E. coli BGs. The application temperature is determined by the respective temperature of E-lysis induction: 44°C for Sf2a and 42°C for E. coli. For medium density fermentations of E. coli Nissle (EcN) BGs with ten-fold higher cell densities (≤ 1.0E+10 cells per ml) where dia-filtration was incorporated into the E-lysis phase the concentration of free DNA could be reduced by at least 30% even before concentration of the broth. This reflected in the amount of required BPL which was only 0.50‰ (v/vf). This showed that in case the amount of residual free DNA in the concentrate can be reliably estimated the required amount of BPL for total inactivation of BG products can be calculated as a function of cell density. A flow cytometry-based (FCM) method for the evaluation of E-lysis in E. coli was presented. Based on a previously suggested assay an improved method was established. Utilizing the change in translucency caused by E-lysis which impacts the cells forward scatter signal and combining this with viability information obtained from the fluorescence signal of membrane potential-sensitive dye DiBac4(3) gave good differentiation between live, whole dead and E-lysed bacteria. Using red-fluorescent dye RH414 as a cell membrane marker enhanced the quality of FCM data as non-celular noise could be effectively excluded. The described method allowed to use FCM as an eligible quality criterion for BG production in quasi realtime. Using a minimal medium for batch production of Escherichia coli Nissle 1917 BGs the productivity could be increased by the factor 10 (medium cell density) as compared to the standard low density fermentation without losing E-lysis efficiency. Good conformance between FCM and conventional cfu data was shown. For this medium density approach using tangential flow filtration was of great value. Due to expulsion of the cytoplasm at elevated cell densities the culture broth viscosity changed significantly and foaming issues occurred. Incorporating a first dia-filtration step into E-lysis phase resolved those problems and also had the beneficial side-effect of removing free DNA from the broth mentioned above. Over a total of nine production cycles a high degree of reproducibility was shown for medium density production of EcN BGs. Average cell densities were 7.35E+09 live EcN per ml while the average E-lysis efficiency was 99.78%. BPL treatment with 0.50‰ (v/vf) was sufficient in all cases yielding a bioburden-free product after lyophilization. In addition, a high-density fed-batch process in minimal medium was presented. Initial data generated showed that it is possible to further increase cell densities by at least a factor 10 (average cell density: 7.06E+10) with respect to the medium density process. It was evident that feeding has to be maintained into E-lysis phase, the feed profile should be decelerated exponentially. With an adequate feeding strategy after E-lysis induction lysis efficiencies > 99.8% were reached.

Autor*innen

Timo Langemann

Haupttitel (Englisch)

Process, development for industrial scale bacterial ghost production

Paralleltitel (Deutsch)

Prozessentwicklung zur Herstellung von Bacterial Ghosts im Industriemaßstab

Publikationsjahr

2011

Umfangsangabe

156, XVIII S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Christoph Herwig ,

Rainer Krull

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.30 Naturwissenschaften in Beziehung zu anderen Fachgebieten

AC Nummer

AC09411277

Utheses ID

13716

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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