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Entwicklung und Anwendung von ELISAs und PCR Methoden zur Detektion von Sesam und braunem Senf in Lebensmitteln
Martina Wolny
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.15293
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29351.88361.479266-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Im Zuge dieser Diplomarbeit sollte eine PCR Methode zur Detektion von braunem Senf entwickelt werden. Außerdem sollten bereits bestehende Methoden zur Detektion von Sesam – eine PCR Methode, ein Sandwich und ein kompetitiver ELISA – bezüglich ihrer Anwend-barkeit auf Modelllebensmittel und kommerzielle Produkte verglichen werden.
Um eine real time PCR Methode für braunen Senf zu entwickeln, wurden zehn Primerpaare entworfen und optimiert. Es wurden 45 Lebens-mittelzutaten mittels PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse auf Kreuzreaktivität getestet. Mit zwei Primerpaaren wurden Taq Man Assays entwickelt. Es erwies sich jedoch keine der entwickelten PCR Methoden als spezifisch für braunen Senf.
Die Nachweisgrenze des Sandwich ELISAs zur Detektion von Sesam lag bei 0,17 mg Sesamprotein pro kg Lebensmittel und die Bestimmungsgrenze bei 0,68 mg Sesamprotein pro kg Lebensmittel. Beim kompetitiven ELISA betrugen die Nachweis- und Bestimmungsgrenze 2,18 und 13,38 mg Sesamprotein pro kg Lebensmittel. Bei der PCR konnte eine Absolutmenge von 10 pg Sesam DNA detektiert werden.
In einem der 45 Lebensmittel, die mit „Kann Spuren von Sesam enthalten“ gekennzeichnet waren, konnte Sesam mittels PCR nachgewiesen werden. Mit dem Sandwich ELISA wurde Sesam in 13 Produkten nachgewiesen. In acht Produkten lagen die Messwerte über der Bestimmungsgrenze. Mit dem kompetitiven ELISA wurden nur 15 Produkte analysiert, für alle wurde eine Sesamkonzentration über der Bestimmungsgrenze ermittelt.
Des Weiteren wurde Sesammehl und bei verschiedenen Temperaturen für zehn Minuten gerösteter Sesam analysiert. Mit Ausnahme des bei 250 °C gerösteten Sesams konnte der temperaturbehandelte Sesam gleich gut detektiert werden wie der unverarbeitete Sesam. Für das Sesammehl wurde bei der PCR etwa der gleiche ct-Wert erhalten wie für die Positivkontrolle, während die Nachweisbarkeit mit dem Sandwich ELISA herabgesetzt war.
Außerdem wurden Modelllebensmittel (Brote und Kekse) mit fünf verschiedenen Konzentrationen an Sesam sowie sesamfreie Produkte hergestellt und mit der PCR Methode sowie den beiden ELISAs analysiert.
Bei den unverarbeiteten Produkten (Mehlmischungen, Keksteigmischungen) wurden mit steigenden Sesamkonzentrationen niedrigere ct-Werte beobachtet. Bei den verarbeiteten Produkten war dieser Trend ebenfalls ersichtlich, nur waren die ct-Werte generell höher und streuten sehr.
Die Nachweisgrenze des Sandwich ELISAs war in Brot und Keksen in etwa gleich der in PBS bestimmten. Nur in Keksteig war die Nachweisgrenze höher. Beim kompetitiven ELISA ergaben sich für alle Matrizes höhere LODs und LOQs als in PBS.
Abstract
(Englisch)
One aim of the present diploma thesis was to develop a real time PCR method for the detection of brown mustard. In addition, three already existing methods for the detection of sesame, a PCR method, a sandwich ELISA and a competitive ELISA, should be compared with regard to their applicability to model foods and commercial food products.
In order to develop a real time PCR method for brown mustard, ten primer pairs were designed and optimised. 45 food ingredients were tested for cross-reactivity by PCR and melt temperature analysis. With two primer pairs Taq Man assays were developed. However, none of the real-time PCR methods was found to be specific for brown mustard.
The limit of detection (LOD) of the sandwich ELISA was 0,17 mg sesame protein/kg food, the limit of quantification (LOQ) 0,68 mg/kg. The LOD and LOQ of the competitive ELISA were 2,18 mg/kg and 13,38 mg/kg, respectively. The LOD of the PCR method was 10 pg of sesame DNA.
With the PCR method sesame was detected in one out of 45 commercial food products that were labelled with “may contain traces of sesame”. With the sandwich ELISA sesame was detected in 13 products. In eight of these food samples the sesame concentration was > LOQ. With the competitive ELISA only 15 products were analysed. Sesame was detected in all of them.
In addition, sesame flour and sesame roasted at different temperatures for ten minutes were analysed with the PCR method and the sandwich ELISA. With the exception of sesame roasted at 250 °C, roasted sesame could be detected with the PCR method and the ELISAs with the same sensitivity as unroasted sesame. Sesame flour resulted in nearly the same ct value as the positive control.
Model foods (bread, cookies, flour and dough) with five different sesame concentrations, as well as samples not containing sesame were analysed with all three methods.
In the case of unprocessed products, higher sesame concentrations resulted in lower ct values. The same trend was observed for processed foods, however, the ct values were generally higher.
In bread and cookies the LOD of the Sandwich ELISA was similar to the LOD in PBS. Only in dough the LOD was higher. In all matrices the LOD of the competitive ELISA was higher than in PBS.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
food allergens sesame brown mustard ELISA PCR
Schlagwörter
(Deutsch)
Lebensmittelallergene Sesam brauner Senf ELISA PCR
Autor*innen
Martina Wolny
Haupttitel (Deutsch)
Entwicklung und Anwendung von ELISAs und PCR Methoden zur Detektion von Sesam und braunem Senf in Lebensmitteln
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
116 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
AC Nummer
AC08924640
Utheses ID
13722
Studienkennzahl
UA | 190 | 406 | 423 |