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Functional analysis of conserved motifs in two Mg 2 + transporting channels
ScMrs2p and TmCorA
Sona Svidova
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Kristina Djinovic-Carugo
DOI
10.25365/thesis.15401
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30032.09663.729469-9
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Thermotoga maritima Cora und Saccharomyces cerevisiae Mrs2 Proteine sind Mitglieder einer großen CorA/Mrs2/Alr1 Protein Superfamilie der Mg2+ Transport-Systeme. Die Konservierung der primären Sequenz in dieser Familie ist relativ gering, mit Ausnahme des Y / F-G-M-N Motivs oder der großen hydrophoben Aminosäuren in dem vermutlichen Gate-Bereich beider Proteine. Um die Rolle dieser konservierten Sequenzen zu untersuchen, präsentiere ich Mutationsstudien des Leucines 294 im Gate-Bereich von TmCorA und des hoch konservierten G-M-N Motivs von ScMrs2.
Das Leu294 im Grenzbereich zwischen Membrane und Cytoplasma im TmCorA Protein gilt als Gate für Mg2+ Transport. Ich habe drei Mutationen an dieser Position geschaffen: Asparaginsäure, Glycin und Arginin. In der Leu294Asp und Leu294Gly Mutante beobachtete ich einen Defekt in der Schließung der Pore. In der Leu294Arg Mutante war nicht nur das Gating, sondern auch die Regulation des Mg2+-Transportes betroffen. Diese Ergebnisse bestätigen die Bedeutung der Leu294 fürs Gating von Mg2+ Transport und zeigen auch den Einfluss von der Ladung und von den strukturellen Eigenschaften der Aminosäuren auf den Gating-Mechanismus.
Das G-M-N Motiv am Ende der ersten Transmembrandomäne des ScMrs2 galt für die Funktion des Proteins als notwendig und bereits eine einzige Mutation in dieser Region schaffte den Mg2+-Transport völlig ab. Ich führte Random-mutagenese aller drei Aminosäuren auf einmal durch und erhielt eine beträchtliche Menge an Mutanten, die unterschiedliche Mg2+-Transportaktivität aufwiesen, in allen Fällen geringer als in dem Wildtyp-ScMrs2. Die Sequenzanalyse zeigte die höchste Mg2+ Transportaktivität im Falle einer hydrophilen Aminosäur auf der ersten Position, und einer hydrophoben Aminosäure an Position 3 und umgekehrt. Die weitere Analyse der Mutanten zeigte veränderte Ionen Selektivität zu Mn2+ und Zn2+, verursacht wahrscheinlich durchs Blocken des Kanals. Aus diesen Ergebnissen schließe ich, dass das G-M-N Motiv wichtig, aber nicht notwendig, für den ScMRS2 vermittelten Mg2+-Transport, und es scheint ein Teil des Ionen-Selektivitätsfilter zu sein.
Abstract
(Englisch)
Thermotoga maritima CorA and Saccharomyces cerevisiae Mrs2 proteins are members of a large CorA/Mrs2/Alr1 protein superfamily of Mg2+ uptake systems. The conservation of the primary sequence in this family is relatively low, with the exception of the characteristic Y/F-G-M-N signature motive or presence of bulky hydrophobic amino acids in the predicted gate region of both proteins. In order to investigate the role of these conserved sequences, I present mutational studies of the Leu294 residue in the gate region of TmCorA and the highly conserved G-M-N motive of ScMrs2.
The Leu294 residue in the cytoplasmic neck of the TmCorA is considered to be the main gate for Mg2+ transport. I created three mutations at this position: aspartic acid, glycine and arginine. In the Leu294Asp and Leu294Gly mutant I observed a defect in the closing of the pore. In the Leu294Arg mutant not just the gating, but also the regulation of Mg2+ uptake was affected. These results confirmed the importance of the Leu294 for gating of Mg2+ transport and also show the influence of the charge and structural features of the amino acids on the gating mechanism.
The G-M-N motive at the end of the first transmembrane of ScMrs2 was considered to be essential for the protein function and already a single mutation in this region completely abolished Mg2+ transport.
I performed random mutagenesis of all three amino acids at once and obtained a considerable amount of mutants, which retained different levels of Mg2+ transport activity, in all cases significantly lower then in the wild-type ScMrs2. Sequence analysis showed the highest Mg2+ uptake levels in case of a hydrophilic amino acid on the first position, and a hydrophobic amino acid on position 3 and vice versa. Further analysis of the mutants showed changed ion selectivity to Mn2+ and Zn2+, caused probably by blockage of the channel. From these we can conclude, that the G-M-N motif is important, but not essential for the ScMRS2 mediated Mg2+ uptake and it seems to be part of the ion selectivity filter.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
ScMrs2 TmCorA magnesium transport yeast mitochondria mutational analysis
Schlagwörter
(Deutsch)
ScMrs2 TmCorA Magnesium Transport Hefe Mitochondrien mutagene Analyse
Autor*innen
Sona Svidova
Haupttitel (Englisch)
Functional analysis of conserved motifs in two Mg 2 + transporting channels
Hauptuntertitel (Englisch)
ScMrs2p and TmCorA
Paralleltitel (Deutsch)
Funktionale Analyse von konservierten Motiven in zwei Magnesium-Transport Kanälen ; ScMrs2 und TmCorA
Publikationsjahr
2011
Umfangsangabe
163 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Wolfgang Löffelhardt ,
Martin Kolisek
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC09412071
Utheses ID
13821
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |